微波預(yù)處理對(duì)熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)的影響

陸 毅 穆冬冬 羅水忠 趙妍嫣 鐘昔陽 姜紹通 鄭 志

(合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院;安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230009)

小麥面筋蛋白又稱谷朊粉，是小麥淀粉加工過程副產(chǎn)物，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為72%～85%，氨基酸組成豐富[1]。小麥面筋蛋白作為一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，被廣泛應(yīng)用于食品、飼料等領(lǐng)域。由于小麥面筋蛋白具有良好的延展性、黏彈性、乳化性和吸水性等功能性質(zhì)，可被用于制作可食性、易降解薄膜[2]、添加到化妝品[3]、寵物飼料中[4]，又由于其良好的凝膠特性，常被作為添加劑加入到面包等烘焙制品、肉丸等肉制品中來改善產(chǎn)品的感官特性和質(zhì)構(gòu)。

蛋白質(zhì)膠凝作用是變性蛋白質(zhì)分子聚集而形成有序的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的過程。熱誘導(dǎo)凝膠是指蛋白質(zhì)受熱變性，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度的展開，變性后的蛋白質(zhì)聚集形成大分子的聚集體，最終產(chǎn)生強(qiáng)度較高且富有彈性的凝膠[5]。但是小麥面筋蛋白緊密的分子結(jié)構(gòu)和較差的親水性限制了其凝膠性能的提高和穩(wěn)定。提高蛋白質(zhì)凝膠性的方法主要包括：物理、化學(xué)、酶及復(fù)合改性等。物理方法由于其操作的簡(jiǎn)便性和安全性引起了許多研究者注意。微波處理作為一種物理改性方法，通過熱能量的變化來改變蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)和分子間的聚集方式，從而改善蛋白質(zhì)的功能特性，成為近年研究熱點(diǎn)[6]。Liu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，相比單純的水浴加熱制備熱誘導(dǎo)大豆分離蛋白凝膠，微波預(yù)處理顯著提高了熱誘導(dǎo)大豆分離蛋白凝膠的彈性模量，并且微觀結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)更為致密的蜂窩狀。Qin等[8]在微波預(yù)處理對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TG酶)促大豆蛋白與小麥面筋蛋白混合凝膠特性影響的研究中發(fā)現(xiàn)，一定程度的微波預(yù)處理導(dǎo)致了蛋白分子結(jié)構(gòu)的松散，促進(jìn)了TG酶的交聯(lián)效率，使其形成了更為致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而顯著提高了混合蛋白凝膠的彈性模量、凝膠強(qiáng)度和持水性等性質(zhì)。

本研究擬通過分析微波預(yù)處理下熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠的強(qiáng)度、持水性、水分分布、表面疏水性、分子間作用力和微觀結(jié)構(gòu)的變化，探究微波預(yù)處理對(duì)熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠性質(zhì)的影響，為改善小麥面筋蛋白凝膠的性質(zhì)及其應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥面筋蛋白：安徽瑞福祥食品有限公司；考馬斯亮藍(lán)G250；8-苯胺-1-萘磺酸：北京索萊寶科技有限公司；牛血清蛋白：上海緣聚生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

WP700TL23-K1型微波儀，格蘭仕微波爐電器有限公司；CR22GⅡ型冷凍離心機(jī)，日本HITACHI公司；TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)儀、Q200-2156型差示掃描量熱儀(DSC)，美國(guó)TA儀器公司；FD-1B-50型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康儀器有限公司；MX-S渦旋混合器，美國(guó)Scilogex公司；MultiskanTMFC型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，Thermo Fisher Scientific公司；721G型分光光度計(jì)，上海精科儀器有限公司；JSM-6490LV型掃描電子顯微鏡(SEM)，日本電子公司。

1.3 小麥面筋蛋白的微波預(yù)處理和熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠的制備

參考Wang[9]等的方法略做修改，蒸餾水配制25 mL、16%小麥面筋蛋白懸浮液，將制備好的懸浮液置于帶有功率和時(shí)間控制器的微波儀中，分別在70、210、350、490、700 W微波功率，90 s微波處理時(shí)間；10、30、50、70、90 s微波處理時(shí)間，700 W微波功率的條件下處理懸浮液。將懸浮液95 ℃水浴加熱40 min，冰水浴冷卻30 min，獲得熱誘導(dǎo)凝膠置于4 ℃冰箱待測(cè)。為防止水蒸氣破壞凝膠結(jié)構(gòu)，采用間歇式加熱，每加熱20 s停頓10 s。以未經(jīng)微波預(yù)處理的小麥面筋蛋白懸浮液經(jīng)過單純的熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠作為對(duì)照組。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

參考孫撬撬等[10]的方法，取1.3制備的熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠，采用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定樣品凝膠強(qiáng)度。

1.4.2 持水性的測(cè)定

參考梁婧等[11]的方法，略作修改。取3 g(記作Wt)1.3制備的凝膠樣品于4 ℃，8 000 r/min條件下離心15 min。將離心后的樣品轉(zhuǎn)移到濾紙上除去水分，再次稱重(記作Wr)。持水性計(jì)算公式：

式中：Wt為離心前凝膠樣品的質(zhì)量；Wr為離心并除去溢出的水分后凝膠的質(zhì)量。

1.4.3 水分分布的測(cè)定

根據(jù)王飛鏑等[12]的方法略作修改，取3～5 mg凝膠樣品于鋁盤中壓盤，以空盤為對(duì)照組。將樣品置于Q200示差量熱掃描儀中，以5 ℃/min的速度從-60 ℃升溫到50 ℃，氮?dú)饬魉?0 mL/min。計(jì)算公式：

凝膠樣品中非凍結(jié)水含量：Wnf=Wt-Wf

式中：Wt為凝膠總含水量；Wf為凝膠中可凍結(jié)水含量；ΔH為凝膠中水的熱焓值/J/g；ΔH0為純水的熱焓值，334 J/g。

1.4.4 表面疏水性的測(cè)定

小麥面筋蛋白凝膠的表面疏水性H0參考Wang等[13]的方法測(cè)定。取0.1 g冷凍干燥后的凝膠樣品溶于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0，15 mL)，8 000 r/min離心15 min后取上清液，上清液蛋白濃度由考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得。將上清液分別稀釋為0.15、0.075、0.038、0.019 mg/mL。取3 mL上清液，加入30μl ANS后測(cè)量熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)：365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：484 nm)。H0為熒光強(qiáng)度相對(duì)蛋白質(zhì)濃度的初始斜率值。

1.4.5 分子間作用力的測(cè)定

根據(jù)Cao等[14]的方法稍作修改。用于溶解熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠樣品的四種磷酸鹽緩沖溶液如下：0.05 moL/L NaCl (PA)；0.6 moL/L NaCl (PB)；0.6 moL/L NaCl+1.5 moL/L尿素 (PC)；0.6 moL/L NaCl+8 moL/L尿素 (PD)。取0.3 g冷凍干燥的凝膠樣品，分別溶于5 mL四種磷酸鹽緩沖溶液中。4 ℃條件下靜置1 h后，8 000 r/min離心20 min取上清液，以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)上清液蛋白濃度。溶解于PB和PA中的小麥面筋蛋白含量之差代表離子鍵的貢獻(xiàn)，溶解于PC和PB中的小麥面筋蛋白含量之差代表氫鍵的貢獻(xiàn)，溶解于PD和PC中的小麥面筋蛋白含量之差代表疏水相互作用的貢獻(xiàn)。

1.4.6 微觀結(jié)構(gòu)的觀察

參考謝新華等[15]的方法，采用掃描電子顯微鏡觀察熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

本研究中每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用SPASS軟件分析數(shù)據(jù)的顯著性(P<0.05)，采用Origin8.0軟件制作圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠強(qiáng)度的分析

凝膠強(qiáng)度是熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠性質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠強(qiáng)度的變化如圖1所示。

由圖1可知，隨著微波功率的增大，凝膠強(qiáng)度呈現(xiàn)出先減小后增大的趨勢(shì)。700 W微波功率時(shí)凝膠強(qiáng)度達(dá)到158.6 g/cm2，顯著高于對(duì)照組的凝膠強(qiáng)度。微波時(shí)間對(duì)凝膠強(qiáng)度的影響也表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)。葉陽等[16]在微波預(yù)處理對(duì)雞蛋清蛋白凝膠強(qiáng)度影響的研究中得到了類似的結(jié)果，認(rèn)為凝膠強(qiáng)度的增大是由于微波預(yù)處理使得小麥面筋蛋白結(jié)構(gòu)松散，導(dǎo)致埋藏在分子內(nèi)部的疏水性基團(tuán)的暴露，進(jìn)而增強(qiáng)了凝膠形成過程中蛋白分子間的疏水相互作用，促進(jìn)了更為穩(wěn)定的蛋白凝膠的形成。

圖1 微波預(yù)處理對(duì)小麥面筋蛋白凝膠強(qiáng)度的影響

2.2 熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠持水性的分析

小麥面筋蛋白凝膠持水性反映了凝膠截留水分的能力，熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠持水性的變化情況如圖2所示。

圖2 微波預(yù)處理對(duì)小麥面筋蛋白凝膠持水性的影響

由圖2可知，當(dāng)微波時(shí)間為90 s時(shí)，隨著微波功率的增加，凝膠持水性略微降低，在210 W時(shí)降至29.26%，隨著功率的進(jìn)一步增加，凝膠持水性顯著增加。在700 W功率條件下，熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠持水性的變化表現(xiàn)出逐漸增大的趨勢(shì)。在700 W，90 s條件下，持水性達(dá)到83.13%。結(jié)果表明了一定程度的微波預(yù)處理能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)-水之間的相互作用，使得更多的水分保留。李秋慧等[17]在微波處理對(duì)大豆-磷脂混合凝膠體系影響的研究中也得到了類似的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)隨著微波功率的增加，復(fù)合凝膠體系的WHC呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)?？赡艿脑蚴且欢ǔ潭鹊奈⒉A(yù)處理改變了蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象，促進(jìn)了更為致密均勻的凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，致密、均勻的凝膠網(wǎng)絡(luò)能夠?qū)⒏嗟乃质`在凝膠體系中，從而增強(qiáng)了凝膠的持水能力。

2.3 熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠中水分分布的分析

通過熱分析法(DSC)研究小麥面筋蛋白凝膠體系中水分的分布，熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠體系中水分分布的變化如圖3所示。

圖3 微波處理對(duì)小麥面筋蛋白凝膠水分分布的影響

凝膠體系中水分分布是凝膠性質(zhì)的重要影響因素，其中蛋白質(zhì)-水之間相互作用對(duì)維持凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)具有重要作用[18],由圖3可知，熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠體系中總含水量的變化不顯著，而當(dāng)微波功率和微波時(shí)間增大時(shí)，體系中的非凍結(jié)水含量呈現(xiàn)出顯著增大的趨勢(shì)。在微波功率700 W，微波時(shí)間90 s條件下，非凍結(jié)水含量達(dá)到25.20%。因此認(rèn)為一定條件下的微波預(yù)處理能夠有效增強(qiáng)小麥面筋蛋白與水分子間的相互作用?！叭龖B(tài)水”理論認(rèn)為，凝膠體系中的水分為非凍結(jié)水和凍結(jié)水兩大類[19]。Hayashi等[20]采用DSC，通過測(cè)定可凍結(jié)水含量分析了大豆分離蛋白中的水分分布情況，發(fā)現(xiàn)非凍結(jié)水與蛋白質(zhì)分子緊密連接在一起。Chen[21]等的研究表明，水分子與蛋白質(zhì)分子以非凍結(jié)水的形式緊密結(jié)合是導(dǎo)致體系具有較高持水性能的重要因素之一。

2.4 熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠表面疏水性的分析

表面疏水性反映了蛋白質(zhì)表面疏水性基團(tuán)的數(shù)量，對(duì)極性條件下的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、構(gòu)象中起著重要作用，對(duì)表面疏水性的分析能夠用來反映蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[18]。熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠表面疏水性的變化如圖4所示。

圖4 微波預(yù)處理對(duì)小麥面筋蛋白凝膠表面疏水性的影響

當(dāng)微波時(shí)間為90 s時(shí)，微波功率在70 W的條件下相比對(duì)照組的表面疏水性增加，而隨著微波功率從70 W增加到700 W時(shí)，表面疏水性逐漸降低。當(dāng)微波功率700 W時(shí)，微波時(shí)間在10 s的條件下表面疏水性相比對(duì)照組的表面疏水性有所增強(qiáng)，而隨著微波時(shí)間的增加，表面疏水性逐漸降低至62.73。蔡建榮等[22]認(rèn)為微波能夠誘導(dǎo)蛋白分子產(chǎn)生空間極化現(xiàn)象，破壞維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的非共價(jià)鍵，使其部分展開，導(dǎo)致疏水性基團(tuán)暴露，表面疏水性增加。隨著微波功率和時(shí)間的增加，極化的蛋白質(zhì)之間通過疏水相互作用，靜電相互作用、氫鍵等非共價(jià)鍵使小麥面筋蛋白發(fā)生聚集，疏水基團(tuán)被重新埋藏起來，表面疏水性減弱。

2.5 熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠分子間作用力的分析

離子鍵、氫鍵、疏水相互作用等化學(xué)鍵是維持小麥蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的主要作用力。根據(jù)不同化學(xué)試劑能夠破壞小麥面筋蛋白凝膠特定的化學(xué)鍵，測(cè)定熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠中分子間作用力的變化。

圖5 微波處理對(duì)小麥面筋蛋白凝膠分子間作用力的影響

如圖5所示，微波預(yù)處理后，氫鍵的貢獻(xiàn)相比對(duì)照組表現(xiàn)出了明顯的降低，這可能是由于微波熱效應(yīng)破壞了部分維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的氫鍵，而在冷卻階段形成的氫鍵較少[9]。在微波功率210 W，處理時(shí)間90 s和微波功率700 W，處理時(shí)間30 s時(shí)，凝膠中疏水相互作用的貢獻(xiàn)分別為0.65 g/L和0.78 g/L，顯著低于對(duì)照組的0.85 g/L。隨著微波作用的加強(qiáng)，疏水相互作用增加至1.69 g/L。有研究報(bào)道[15, 23-24]，在蛋白凝膠形成過程中疏水相互作用是維持蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)的主要作用力之一，而增強(qiáng)的作用力有利于凝膠形成致密、穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

2.6 熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白微觀結(jié)構(gòu)的分析

SEM的測(cè)定評(píng)估了微波預(yù)處理對(duì)小麥面筋蛋白凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響。熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的變化如圖6所示。

注：a:對(duì)照組；b、c、d、e、f、:微波功率700 W，微波時(shí)間10、30、50、70、90 s預(yù)處理后小麥面筋蛋白凝膠。圖6 微波預(yù)處理對(duì)小麥面筋蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

由圖6可知，對(duì)照組的微觀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)呈圓孔網(wǎng)絡(luò)狀，孔隙較大且粗糙。而經(jīng)過微波預(yù)處理的熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠則具有更為致密、平滑和均勻的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。Ji等[25]在微波預(yù)處理對(duì)鱈魚魚糜-魔芋膠混合凝膠性質(zhì)影響的研究中發(fā)現(xiàn)，鱈魚魚糜和魔芋膠經(jīng)過微波預(yù)處理后形成了網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更為致密、均勻的混合凝膠。凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是其持水性等凝膠性質(zhì)的重要影響因素。Chen[26]等的研究認(rèn)為致密均勻的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能夠?qū)⑺指玫氖`在凝膠體系中，進(jìn)而改善其持水性等凝膠性質(zhì)。因此可以認(rèn)為適當(dāng)?shù)奈⒉A(yù)處理能夠有效改善熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

微波預(yù)處理通過誘導(dǎo)小麥面筋蛋白發(fā)生空間極化現(xiàn)象及分子結(jié)構(gòu)的部分展開，能夠顯著增大熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠的凝膠強(qiáng)度和持水性，分別比對(duì)照組提高83.4%和162%，表面疏水性降低至62.73；當(dāng)微波功率為700 W，微波時(shí)間90 s時(shí)，疏水相互作用貢獻(xiàn)增加，并促使了孔隙更為致密、均勻的熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠三維網(wǎng)絡(luò)的形成。因此可認(rèn)為微波預(yù)處理能夠有效地改善熱誘導(dǎo)小麥面筋蛋白凝膠的性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)，可以為改善小麥面筋蛋白凝膠的性質(zhì)及其在食品工業(yè)的應(yīng)用提供新思路。