RIP1 與TNF-α 誘導(dǎo)信號通路關(guān)系的研究進(jìn)展

李承宗

腫瘤壞死因子是一類具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡功能的細(xì)胞因子，可由多種細(xì)胞分泌、表達(dá)，其生物學(xué)功能主要涉及細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)炎癥應(yīng)答、參與免疫調(diào)節(jié)等。TNF-α是腫瘤壞死因子家族最重要的細(xì)胞因子，主要通過上調(diào)MAPK、ERK、NF-κB等信號通路來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及促炎癥作用，發(fā)揮其生理學(xué)作用。越來越多的研究證實TNF-α可通過與它的重組人1型腫瘤壞死因子受體（Recombinant Human Tumor Necrosis Factor Receptor Type 1，TNFR1）結(jié)合后啟動了下游的信號通路。RIP1是復(fù)合體I中的一種組成因子，在人體中能夠控制包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生存及死亡過程。RIP1目前已經(jīng)成為臨床醫(yī)學(xué)控制人類炎癥反應(yīng)、治療惡性腫瘤疾病的新靶點和熱點話題。因此，本文根據(jù)RIP1與TNF-α誘導(dǎo)信號炎癥通路的相關(guān)性進(jìn)行綜述，為探索RIP1及TNF-α誘導(dǎo)信號通路關(guān)系治療人類惡性腫瘤疾病提供參考策略。

1 RIP1 結(jié)構(gòu)和復(fù)合體相關(guān)概述

1.1 RIP復(fù)合體家族構(gòu)成

RIP復(fù)合體家族是具有特異性的N末端絲氨酸（serine）、N末端蘇氨酸（threonine） 的一系列激酶活性蛋白。目前臨床上發(fā)現(xiàn)RIP家族共7個成員，分別為RIP1-RIP7[1-2]。RIP1-RIP7的N末端結(jié)構(gòu)具有高度同源性，激酶結(jié)構(gòu)域具有相似性，另外提示RIP1-RIP7蛋白家族成員可能具有某種相同或者相似的生物學(xué)功能。而RIP1-RIP7家族的中間結(jié)構(gòu)、C端結(jié)構(gòu)之間存在一定的差異，研究發(fā)現(xiàn)RIP復(fù)合體家族中的RIP1里的C端結(jié)構(gòu)含有一個死亡結(jié)構(gòu)域（DD，death domain），但是中間結(jié)構(gòu)則包含一個RIP同型結(jié)構(gòu)域（RHIM，a RIP homotypic interaction motif）和一個與相互連接的中間域（ID，a bridging intermediate domain）；RIP復(fù)合體家族中的RIP2里的C端結(jié)構(gòu)則含有一個caspase募集域（CARD，caspase recruitment domain），但是其中間結(jié)構(gòu)僅包含有一個ID；另外RIP3比較特別，RIP3的C端結(jié)構(gòu)是RHIM且缺少中間結(jié)構(gòu)域；RIP4和RIP5的C端結(jié)構(gòu)都是錨蛋白域（ankyrin domains，AD），但是其中間結(jié)構(gòu)則是ID；最后的RIP家族成員RIP6和RIP7的結(jié)構(gòu)與其它RIP家族成員相關(guān)性較弱，目前國內(nèi)外關(guān)于RIP4-7的功能的相關(guān)研究甚少[3]。筆者認(rèn)為了解RIP家族各成員尤其是RIP1結(jié)構(gòu)的具體了解能夠幫助臨床學(xué)者更好地探討RIP家族的生物學(xué)功能。

1.2 RIP1的分子結(jié)構(gòu)分析

RIP1中間域上有一種物質(zhì)為賴氨酸377（Lysine 377，Lys377），Lys377同時也是泛素分子Lys63介導(dǎo)的一個重要的泛素化RIP1位點，通過對RIP1位點發(fā)生泛素化影響后Lys377可以與其他泛素受體蛋白相結(jié)合并形成復(fù)合體，此時RIP1能夠與非依賴k基因結(jié)合核因（Nuclear Factor-k-gene Binding，NF-κB）發(fā)生轉(zhuǎn)錄，并通過這種方式調(diào)節(jié)人體細(xì)胞的生存狀態(tài)[4]，但是目前尚未有臨床研究對RIP1其他位點泛素化情況進(jìn)行統(tǒng)一、明確的定義及分析。RIP1上的RHIM具有調(diào)節(jié)其他含有RHIM蛋白或相關(guān)因子的家族成員如RIP3進(jìn)行相互作用的功能，RIP1在這一過程中能夠與RIP3中的RHIM相互作用并形成一個絲狀淀粉樣結(jié)構(gòu)，且這一結(jié)構(gòu)對調(diào)節(jié)人體中的壞死性凋亡（necroptosis）機(jī)制具有決定性作用。

RIP1成員中的C末端DD是6螺旋折疊的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，而這種6螺旋折疊結(jié)構(gòu)在TNF-受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（TNF receptor-1-associated death domain protein，TRADD）和FAS相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD，F(xiàn)AS-associated death domain protein）中同樣存在，另外RIP1成員的DD能夠參與如細(xì)胞膜上與死亡配體刺激下產(chǎn)生受體復(fù)合物的結(jié)合的細(xì)胞同質(zhì)蛋白的相互作用以及在細(xì)胞內(nèi)形成復(fù)合物如與FADD的死亡結(jié)構(gòu)域的結(jié)合引起凋亡（apoptosis）并起到調(diào)節(jié)下游信號的作用等[5]。

1.3 RIP1 成員的生物學(xué)功能分析

國內(nèi)外關(guān)于RIP1功能的臨床研究中發(fā)現(xiàn)RIP成員能夠引起細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是RIP1成員里的中間結(jié)構(gòu)域RHIM與RIP3成員相互作用并形成功能性淀粉樣信號復(fù)合物（functional amyloid signaling complex），而這種信號復(fù)合物能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性凋亡。RIP1成員對細(xì)胞的生存和死亡起決定作用，是信號通路下游死亡受體信號的中央控制器。陳瑤等[6]在一項敲除RIP1基因的小鼠相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，敲除RIP1基因的小鼠仍然可以正常地出生并生長，但是當(dāng)小鼠出生后會出現(xiàn)脂肪組織細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的廣泛死亡，最終敲除RIP1基因的小鼠在3天之內(nèi)全部死亡；另外Schneider等人[7]在研究中利用re-loxP 基因重組技術(shù)在敲除RIP1基因小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)單獨敲除腸上皮細(xì)胞或者肝細(xì)胞的RIP1基因表達(dá)小鼠對小鼠的發(fā)育并沒有發(fā)現(xiàn)較為明顯的影響，提示RIP1基因可能是機(jī)體免疫淋巴系統(tǒng)存活和發(fā)育的關(guān)鍵性因子，作用重要。Luan等人[8]在研究中報道了成纖維細(xì)胞敲除RIP1基因后比成纖維細(xì)胞沒有敲除RIP基因?qū)τ赥NF-α誘導(dǎo)的凋亡機(jī)制敏感性更高，另外在Jurkat細(xì)胞敲除RIP1基因后也觀察到相似的現(xiàn)象和情況，提示RIP1基因可能是TNF-α誘導(dǎo)的促生存、抗凋亡和炎癥反應(yīng)發(fā)生信號通路上的重要因子。

2 RIP 基因與TNF-α 誘導(dǎo)的促細(xì)胞生存、炎癥反應(yīng)的信號通路關(guān)系

2.1 RIP1基因參與構(gòu)成、維持復(fù)體物I的過程

TRADD，RIP1，TRAF2，and cIAP1/2在促生存、抗凋亡和炎癥反應(yīng)發(fā)生信號通路的TNF-α信號誘導(dǎo)下與胞內(nèi)段的TNFR1構(gòu)成復(fù)體物Ⅰ相結(jié)合并形成復(fù)合物，而RIP1基因是復(fù)合物Ⅰ的重要組成因子，另外研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合物Ⅰ的主要功能是激活MAPKs/AP-1信號通路和NF-κB信號通路并促進(jìn)人體細(xì)胞的生存以及導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

2.2 RIP1基因參與調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB信號通路過程

NF-κB活化過程已經(jīng)被多項臨床研究證明與人體的多種侵襲性惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有密切相關(guān)性，另外在TNF-α誘導(dǎo)的包括NF-κB等眾多激活物中可能是最快速、有效的激活因子[9]。RIP1基因通過與連接在K377的位點上的K63泛素鏈相互鏈接能夠與TAK1（transforming growth factor（TGF）-β-activated kinase 1）信號通路、TAB2/3 （TAK1-binding proteins 2 and 3）信號通路相結(jié)合，結(jié)合后TAK1信號通路和TAB2/3信號通路能夠激活由調(diào)節(jié)亞單位IKKγ和兩個催化亞單位 IKKα和 IKKβ 組成的IKK復(fù)合物，而這個過程會引起細(xì)胞胞質(zhì)中的NF-κB三聚物中的IκBα發(fā)生磷酸化反應(yīng)，另外發(fā)生磷酸化反應(yīng)后的IκBα被K48相互連接泛素化鏈進(jìn)行修飾，最終使蛋白質(zhì)發(fā)生降解。游離的NF-κB迅速移位到細(xì)胞核后與失去IκBα的暴露核定位位點 NF-κB分離，同時與特異性κB序列進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞中的促生存信號的基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄行為，提示泛素化RIP1基因在激活NF-κB信號通路中具有重要作用。相關(guān)臨床研究對存在RIP基因缺陷的Jurkat細(xì)胞、惡性黑色瘤細(xì)胞、肝癌細(xì)胞進(jìn)行報道并發(fā)現(xiàn)，TNF-α不能誘導(dǎo)并激活NF-κB 信號通路，但是TNF-α在FAS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)機(jī)制中沒有相應(yīng)的作用，提示RIP1基因是TNF-α可能是激活NF-κ信號通路中的關(guān)鍵因子[10-11]。但是相關(guān)臨床學(xué)者在研究中認(rèn)為RIP1基因在TNF-α激活NF-κB信號通路中不是必需的，不管是藥物抑制或者突變失活均會使RIP1基因失去活性，因此在TNF-α誘導(dǎo)下的NF-κB信號通路中活化作用沒有起到任何的作用。Filliol等人報道了小鼠成纖維細(xì)胞和肝細(xì)胞中的TNF-α激活NF-κB的反應(yīng)中沒有發(fā)現(xiàn)RIP1基因的參與[12]，提示RIP1基因?qū)NF-α激活的NF-κB信號通路的調(diào)控作用可能存在不同組織類型、細(xì)胞之間的差異，但是目前尚未有明確的結(jié)論分析相關(guān)機(jī)制，需要進(jìn)一步研究。

3 RIP1 基因抑制TNF-α 誘導(dǎo)Caspase-8 介導(dǎo)的凋亡信號通路相關(guān)性

TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程需要Caspase-8進(jìn)行活化發(fā)揮作用，同時TNF-α也是外源性凋亡機(jī)制發(fā)揮作用的重要因子。TNF-α在TNFR1信號通路中除了通過復(fù)合體Ⅰ急性激活并起到促生存、炎癥反應(yīng)的作用外，TNF-α還可以通過TRADD與RIP1基因、FADD、Caspase-8形成復(fù)合體Ⅱa，而復(fù)合體Ⅱa一般以酶原的狀態(tài)存在于無活性的Caspase-8中，進(jìn)一步聚集后迅速活化并觸動信號通路下游的其他Caspase因子最終發(fā)動聯(lián)級反應(yīng)，通過這一過程啟動細(xì)胞凋亡的開始。劉誠林[13]報道了腸上皮細(xì)胞單獨敲除RIP1基因小鼠且結(jié)果發(fā)現(xiàn)腸上皮細(xì)胞同時發(fā)生了TNF-α誘導(dǎo)、Caspase-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程，提示RIP1基因在抑制TNF-α誘導(dǎo)、Caspase-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程種占據(jù)重要地位。RIP1基因同時具有抑制凋亡進(jìn)而加速凋亡的作用，表明RIP1基因可能通過不同狀態(tài)參與人體中的不同信號通路的調(diào)控過程。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)RIP1基因中的Lys377Arg泛素化的重要位點被突變后，RIP1基因能夠從抑制凋亡的信號通路轉(zhuǎn)變?yōu)閰⑴cTNF-α誘導(dǎo)、Caspase-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號通路，提示泛素化RIP1基因在TNF-α促生存、抗細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)信號通路中起重要作用。

4 泛素化狀態(tài)對RIP1 基因的調(diào)控過程

研究中發(fā)現(xiàn)在TNF-α信號通路下對RIP1基因進(jìn)行5分鐘的誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)RIP1基因迅速聚集到complex I中，此時發(fā)現(xiàn)RIP1基因的泛素化受到抑制，同時也進(jìn)一步抑制了NF-κB的活性[14]，提示TNF-α對RIP1基因泛素化起到?jīng)Q定性作用。一項臨床研究中對TRAF2、TRAF5基因缺陷的大鼠進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)RIP1基因的泛素化狀態(tài)會受到嚴(yán)重抑制，另外TRAF2基因可以增加K63對RIP1基因的泛素化鏈接程度，而cIAP1基因和cIAP2基因則對RIP1基因泛素化調(diào)節(jié)沒有起到任何的作用[15]。

RIP1基因能夠通過8個類型的泛素化鏈來實現(xiàn)泛素化，這8個類型分別是Lys6，Lys11，Lys33，Lys48，Lys27，Lys29， Lys63 、Met1[16]。另外在TNF-α誘導(dǎo)下Lys377是RIP1基因泛素化的唯一結(jié)合位點；研究中對Lys48引導(dǎo)泛素化鏈對RIP1泛素化作用進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Lys48能夠引起RIP1基因蛋白酶體降解導(dǎo)致調(diào)節(jié)功能顯著下調(diào)[17-18]；Lys63引導(dǎo)的泛素化鏈對RIP1基因的泛素化作用比較特別，它能夠上調(diào)RIP1基因調(diào)控的信號程度，而Lys48則會降低RIP1基因調(diào)控的信號程度。

此外，LUBAC是RIP1基因泛素化鏈形成的重要組成部分，信號通路下游的復(fù)合物包括NEMO會與IKKα以及IKKβ進(jìn)行結(jié)合，同時激活細(xì)胞中IKKβ的活性，并對NF-κB的活性起到調(diào)節(jié)作用；臨床學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)K63引導(dǎo)的RIP1基因泛素化在TNFα信號誘導(dǎo)的NF-κB信號通路中沒有發(fā)現(xiàn)必要的作用。

5 RIP1 基因參與TNF-α 誘導(dǎo)惡性腫瘤的相關(guān)性

RIP1基因可能促進(jìn)惡性腫瘤疾病的發(fā)生和發(fā)展，由于RIP1基因蛋白在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌、宮頸癌、膽囊癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，推測與患者的預(yù)后存在密切的相關(guān)性[19]。有臨床學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)報道，RIP1基因蛋白在肝癌患者組織細(xì)胞中呈低表達(dá)，而RIP1基因高表達(dá)可能意味著肝癌患者預(yù)后更好[20]，提示RIP1基因在惡性腫瘤組織中可能存在著一定的特異性。RIP1基因能夠通過激活 NF-κB信號通路調(diào)節(jié)mdm2 并抑制 P53，P53在促進(jìn)機(jī)體惡性膠質(zhì)瘤發(fā)展中起到重要作用，提示RIP1基因激活 NF-κB信號通路后的持續(xù)活化是導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞生長的重要因素。

臨床研究普遍認(rèn)為TNF-α在促進(jìn)惡性腫瘤疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著決定性作用，隨著我國基因重組技術(shù)的發(fā)展為探討RIP1基因在TNF-α信號通路中的作用提供了研究依據(jù)，但是惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個復(fù)雜、動態(tài)變化的過程，因此需要進(jìn)一步收集大量的樣本數(shù)據(jù)分析 RIP1基因在惡性腫瘤中的作用，而隨著對RIP1基因在惡性腫瘤影響研究的深入分析，能夠為人類惡性腫瘤疾病的治療提供新的參考依據(jù)。