線粒體的功能及其在生殖中的作用

王雪瑩 謝聰聰 姚冠峰 郭曉麗 綜述 劉效群 審校

河北省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究院(石家莊，050071)

線粒體位于真核生物細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，是有氧呼吸及產(chǎn)生ATP的主要場所，被稱為細(xì)胞的核電站，同時會產(chǎn)生一定數(shù)量的活性氧(ROS)。線粒體受損時，釋放大量的ROS和細(xì)胞凋亡因子，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，線粒體損傷是細(xì)胞凋亡和壞死的重要途徑[1]。線粒體是一種半自助性的細(xì)胞器，具有自己的遺傳物質(zhì)線粒體DNA(mtDNA)，能獨立復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯13種線粒體蛋白，其余必要的蛋白質(zhì)需要細(xì)胞核DNA編碼。線粒體是母系遺傳，子代的mtDNA大部分來源于母親，因此，可利用母親的線粒體方法追蹤家族譜系。對于mtDNA基因突變的患者，可用捐贈者正常的mtDNA替換有缺陷的mtDNA，此技術(shù)已應(yīng)用在輔助生殖技術(shù)中[2]。

1 線粒體的功能

1.1 氧化磷酸化

線粒體是細(xì)胞進行氧化磷酸化和合成ATP的主要場所，也是糖類、脂質(zhì)和氨基酸等物質(zhì)最終氧化釋能的場所。糖類和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中通過降解產(chǎn)生丙酮酸和脂肪酸，在氧化磷酸過程中這些物質(zhì)進入線粒體基質(zhì)，經(jīng)過一系列分解代謝形成乙酰輔酶A，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和黃素腺嘌呤二核苷酸遞氫體(FADH2)脫氫，經(jīng)線粒體內(nèi)膜的呼吸鏈逐級傳遞，最終傳遞給氧。在氧化磷酸化過程中，會生成少量ROS，但在線粒體內(nèi)源性抗氧化機制下可以抵消[3]。

1.2 內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)

在氧化磷酸化過程中，電子傳遞鏈會產(chǎn)生少量以超氧化物自由基形式存在的ROS。在電子傳遞鏈中，電子流動可以減少超氧離子(O2-)。線粒體中的錳超氧化物歧化酶(MnSOD)，可以將過氧化氫氧化成低活性過氧化氫。過氧化氫可以發(fā)生芬頓反應(yīng)，產(chǎn)生的羥基自由基(OH-)損傷脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸。存在于線粒體膜間隙的谷胱甘肽(GSH)過氧化物酶可以將過氧化氫轉(zhuǎn)化為水。損傷的線粒體可以增加內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的活性。例如，NADH缺乏會增加了MnSOD的表達，從而將超氧化物轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞中的過氧化氫[4]。

1.3 鈣緩沖

電子跨線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運產(chǎn)生一個負(fù)跨膜電勢，為陽離子進入基質(zhì)提供強大的驅(qū)動力，促使內(nèi)膜上的鈣轉(zhuǎn)運蛋白將Ca2+移至線粒體內(nèi)，從而改變胞液Ca2+濃度，這對于Ca2+參與細(xì)胞內(nèi)各種信號通路極其重要。研究發(fā)現(xiàn)線粒體內(nèi)膜具有選擇性屏障作用，線粒體外膜具有調(diào)節(jié)Ca2+的屏障作用。在正常情況下，細(xì)胞質(zhì)中Ca2+的濃度為0.1μM，細(xì)胞外的Ca2+濃度為1mM，這種濃度差有利于Ca2+進入細(xì)胞質(zhì)[5]。線粒體內(nèi)膜潛在-180mv電壓，有利于Ca2+流入到胞質(zhì)，直到線粒體基質(zhì)內(nèi)的Ca2+濃度比細(xì)胞質(zhì)高106才達到平衡。一旦Ca2+進入胞質(zhì)，就克服了陽離子強大的驅(qū)動力。重要的是，Ca2+需要不同的新陳代謝酶來激活，例如丙酮酸脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶。鈣離子流入線粒體基質(zhì)促進新陳代謝，通過與這些代謝酶相互作用加速新陳代謝，增加細(xì)胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生[6]。

1.4 線粒體功能障礙及其機制

線粒體功能障礙多指因線粒體膜受到破壞，呼吸鏈?zhǔn)芤种?，酶活性降低，mtRNA的損傷等引起的能量代謝障礙，進而導(dǎo)致一系列相互作用的損傷過程。線粒體功能障礙可使呼吸鏈酶活性下降，線粒體膜電位降低，ATP合成減少，細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)破壞，線粒體離子通透性改變，脂肪酸的β-氧化受阻，細(xì)胞內(nèi)脂肪酸蓄積，氧化應(yīng)激增加，mtDNA氧化損傷導(dǎo)致線粒體生物合成降低，進一步加重線粒體功能障礙，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或死亡[7]。

線粒體功能障礙與許多疾病相關(guān)，例如卵巢儲備功能減退、糖尿病、帕金森病、阿爾茨海默癥、腫瘤、脂肪肝、肌肉萎縮癥、黃斑變性和神經(jīng)退化及其并發(fā)癥等。在某些疾病中，mtRNA基因缺陷會導(dǎo)致線粒體功能紊亂，引起正常的線粒體電子傳遞鏈損傷。線粒體功能障礙也涉及許多創(chuàng)傷性的病變，包括心肌梗死、中風(fēng)、腦外傷和脊椎損傷[8]。

2 線粒體與生殖

線粒體是母系遺傳，因為精子線粒體蛋白泛素化并在進入卵母細(xì)胞后通過蛋白酶體和自噬進行降解，但造成這種現(xiàn)象的機制尚不清楚。有學(xué)者認(rèn)為精子線粒體的程序性凋亡是為了保護胚胎免受其攜帶的異常突變的影響，因為精子發(fā)生過程是暴露在高活性氧中。也有可能是精子線粒體的自行退化保護子代免受精子線粒體在進入卵母細(xì)胞形成較高水平的異質(zhì)性[9]。

線粒體的數(shù)量和活性在哺乳動物胚胎發(fā)育過程中與細(xì)胞周期不同步，而是隨胚胎發(fā)育進程而改變，其異常將導(dǎo)致卵子和胚胎質(zhì)量低下。線粒體在生殖嵴的原始生殖細(xì)胞中只有不到10個，卵原細(xì)胞中達到200個，初級卵母細(xì)胞約有6000個，而在成熟的卵細(xì)胞中則增加到10萬個以上。在胚胎發(fā)育過程中，每個胚胎細(xì)胞的線粒體數(shù)量隨著胚胎分裂而減少，但胚胎的線粒體總量保持穩(wěn)定，直至囊胚期開始增多。排卵前卵母細(xì)胞線粒體處于靜息狀態(tài)，形態(tài)呈圓形或梨形，幾乎沒有嵴，基質(zhì)濃密且內(nèi)外膜并置；排卵后、卵子受精至囊胚階段，線粒體伸長，嵴逐漸出現(xiàn)并增多。在多數(shù)哺乳動物胚胎著床前線粒體處于靜息狀態(tài)，發(fā)育至囊胚階段其結(jié)構(gòu)完整，功能活躍，并重啟復(fù)制，為后續(xù)胚胎發(fā)育提供能量[10]。

線粒體在生殖中起著非常重要的作用，大量研究表明，mtDNA異質(zhì)性與機體機能減退或衰老以及許多疾病相關(guān)。研究表明，小鼠高mtDNA異質(zhì)性水平能夠降低雌性個體繁殖水平，導(dǎo)致雌性不育，降低小鼠壽命以及影響其大腦發(fā)育，表明高水平mtDNA異質(zhì)性能夠減弱機體機能[11]。mtDNA異質(zhì)性水平隨年齡增大而增加，但mtDNA 突變累積與衰老之間的因果關(guān)系尚不明確。誘導(dǎo)mtDNA突變的轉(zhuǎn)基因小鼠生育能力嚴(yán)重下降。線粒體異質(zhì)體會影響人類卵母細(xì)胞的生育能力[12]。并且線粒體對調(diào)節(jié)受精過程中的鈣振蕩起著關(guān)鍵的作用，鈣振蕩對于胚胎的發(fā)育是至關(guān)重要的。當(dāng)線粒體功能受到抑制時，鈣振蕩模式就會發(fā)生改變[13]。此外，線粒體功能和DNA含量決定了受精的結(jié)果。線粒體DNA含量也與人類卵母細(xì)胞受精有關(guān)。在哺乳動物中未受精的卵母細(xì)胞具有較低的mtDNA拷貝數(shù)，而退化的卵母細(xì)胞的拷貝數(shù)更少。在哺乳動物受精失敗的卵母細(xì)胞中，mtDNA的數(shù)目較少，這可能提示細(xì)胞質(zhì)成熟障礙[14]。

豬卵母細(xì)胞中，mtDNA拷貝數(shù)和線粒體活性對孤雌激活起著重要作用；然而，mtDNA拷貝數(shù)似乎對豬卵母細(xì)胞成熟并不重要，但線粒體膜缺失會造成卵母細(xì)胞成熟障礙[15]。在體外受精過程中，mtDNA拷貝數(shù)發(fā)生改變會影響胚胎發(fā)育，但似乎不影響卵母細(xì)胞的成熟。在小鼠中，線粒體活性對于卵母細(xì)胞的成熟和后期的胚胎發(fā)育非常重要。另一研究表明，小鼠卵母細(xì)胞中抑制線粒體氧化磷酸化會嚴(yán)重降低其發(fā)育為囊胚的幾率[16]，也有研究表明，雖然小鼠的mtDNA拷貝數(shù)較低，足以支持受精和植入前發(fā)育，但胚胎植入后發(fā)育潛能不佳[17]。在植入后，小鼠胚胎發(fā)育所需的線粒體mtDNA拷貝數(shù)閾值為40 000～50 000。在人類中，卵母細(xì)胞具有高水平的ATP與優(yōu)質(zhì)胚胎率和種植率有關(guān)[18]?；谶@些研究，可認(rèn)為卵母細(xì)胞成熟需要較多的線粒體，卵母細(xì)胞中一定數(shù)量的線粒體對于支持胚胎的早期發(fā)育是必不可少的。

隨著年齡的增加，卵母細(xì)胞的質(zhì)量下降，胚胎非整倍體數(shù)量明顯增加。研究表明，隨著小鼠年齡的增加，卵母細(xì)胞產(chǎn)生的ATP數(shù)量下降，衰老的小鼠和倉鼠的卵母細(xì)胞ATP和mtDNA拷貝數(shù)均減少，線粒體的超微結(jié)構(gòu)異常[19]。Burgestaller[20]檢測了39個健康母親的多種線粒體等位基因，發(fā)現(xiàn)子代線粒體異質(zhì)性與母親妊娠的年齡成正相關(guān)，表明隨著年齡的增加，卵母細(xì)胞mtDNA累計的突變量會遺傳給子代。

3 線粒體移植

線粒體功能障礙與各種生育障礙相關(guān)。卵胞質(zhì)移植技術(shù)已應(yīng)用于胚胎發(fā)育不良和胚胎反復(fù)種植失敗的患者中。1997—2001年，約有30個孩子因此技術(shù)出生。因涉及倫理問題，有些國家(美國)禁止此項技術(shù)應(yīng)用于臨床，只有印度、新加坡、德國等一些國家允許開展此項技術(shù)[21]。

3.1 線粒體替代法

隨著顯微操作技術(shù)的不斷發(fā)展和胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查技術(shù)的廣泛應(yīng)用，線粒體替代法(MRT)為阻斷線粒體疾病的子代遺傳和改善卵母細(xì)胞質(zhì)量提供了新的手段。

3.1.1原核移植原核移植(PNT)是指在患者和供者的MⅡ期卵子同時行ICSI，并在患者和供者同時形成原核時，將患者的雙原核取出，轉(zhuǎn)移至去核的供體受精卵中。1980年初，McGrath等[22]將在小鼠受精卵中應(yīng)用PNT技術(shù)，并成功產(chǎn)生后代。1990年Ato等[23]首次提出運用PNT技術(shù)預(yù)防m(xù)tDNA疾病。用異常受精的卵子探索人類受精卵中PNT的潛力。此技術(shù)上是可行的并且在體外可發(fā)育到囊胚。最近研究表明運用PNT技術(shù)可增加有活力的受精卵數(shù)量，受精卵在核轉(zhuǎn)移后線粒體突變殘留不到2%，可有效降低缺陷性線粒體的數(shù)量，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于迄今研究疾病的突變閾值[24]。因此，PNT有減少線粒體疾病發(fā)生的潛力，具有臨床應(yīng)用前景。

3.1.2細(xì)胞質(zhì)移植細(xì)胞質(zhì)移植是指行ICSI的同時將少量年輕女性卵子的細(xì)胞質(zhì)注入高齡不孕女性卵子內(nèi)，能有效提高其妊娠率。細(xì)胞質(zhì)移植技術(shù)能提高卵母細(xì)胞質(zhì)量和早期胚胎發(fā)育能力，改善反復(fù)體外受精失敗患者的臨床結(jié)局。1997年，卵胞質(zhì)移植技術(shù)首次應(yīng)用于大齡不孕患者并獲得成功[25]。2015年Cree隨訪17例患者中，出現(xiàn)了2例特納綜合征和1例廣泛性發(fā)育障礙，認(rèn)為線粒體的異質(zhì)性或許通過表觀遺傳影響子代性狀，或許由操作本身影響染色體的穩(wěn)定性，給子代帶來即時或長期的健康隱患[24]。2015年世界第一例線粒體捐贈的嬰兒在英國誕生。

3.1.3紡錘體移植目前最有前景的策略是在MII阻滯的卵母細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移核基因組。MII期卵母細(xì)胞染色體不封閉在核膜內(nèi)，而是在MII紡錘體軸上對齊，等待精子穿越透明帶，啟動MII后期。普通顯微鏡看不到紡錘體或染色體，標(biāo)準(zhǔn)做法是使用液晶雙折射觀察紡錘體軸。然而，這方法可能導(dǎo)致染色體排列不整齊或分散。盡管這項技術(shù)具有挑戰(zhàn)性，但已有實驗證實恒河猴卵母細(xì)胞進行MII紡錘體移植(MST)后出生的恒河猴未檢測到攜帶mtDNA的突變。后續(xù)人類卵母細(xì)胞實驗表明MST會攜帶少量的mtDNA突變，但是MST卵母細(xì)胞受精會有原核數(shù)目異常的高發(fā)生率(48%)[26]。

3.2自體生殖細(xì)胞線粒體移植

自體生殖細(xì)胞線粒體移植(AUGMENT)以自體細(xì)胞為材料，減輕了倫理問題且操作簡單而備受關(guān)注[27]。這個替代方法增加了卵母細(xì)胞線粒體數(shù)量，也可通過去線粒體自溶注入來提高卵母細(xì)胞的性能。Tzeng等[28]在2001年首次報道，使用患者自體顆粒細(xì)胞線粒體移植至卵細(xì)胞進行輔助生殖并獲得妊娠。孔令紅等[29]也報道，通過AUGMENT已使多例患者獲得了臨床妊娠并分挽。加拿大OvaScience 公司分離患者卵巢干細(xì)胞并從中提取線粒體進行自體卵細(xì)胞移植，成功誕下第一位“干細(xì)胞嬰兒”。 通過行自體線粒體移植，給卵母細(xì)胞提供補充了受精和繼續(xù)發(fā)育所需的能量，明顯改善了胚胎的質(zhì)量，并提高了妊娠率，是治療線粒體異常導(dǎo)致的卵巢儲備功能減退引起不孕或多次胚胎移植失敗患者的有效方法[15]。

4 倫理問題

英國已成為世界上第一個正式加入歐盟線粒體捐獻的國家。2015年10月在英國人類受精和胚胎學(xué)管理局的許可下成立線粒體捐贈機構(gòu)，這對于有嚴(yán)重線粒體缺陷的家庭生育健康的寶寶提供了極大的幫助。2016年美國專家小組提出要遵守接受線粒體捐贈者只能生育男嬰這一準(zhǔn)則，從而避免了捐贈的線粒體遺傳其后代[30]。

捐贈者與接受者的關(guān)系存在倫理困境。線粒體攜帶自身DNA，因此，接受捐贈的孩子，會與三方有基因聯(lián)系:孩子的父母和捐贈者。目前，已有幾例利用卵胞質(zhì)移植技術(shù)的孩子出生。這些人和他們的捐贈者并未試圖相互聯(lián)系。但這些案例的數(shù)量較少，不具有完全的說服力。已有接受者表示不會把捐贈者視為第二位母親。事實上，線粒體捐贈者的DNA占比僅為0.1%，不考慮捐贈者為第二位母親是合理的。參考器官捐獻的經(jīng)驗，孩子和捐贈者可能會在未來產(chǎn)生聯(lián)系對方的想法。因此需要在法律層面規(guī)范線粒體捐贈技術(shù)，以保證相關(guān)信息的保密性和聯(lián)系方式的可及性。

線粒體自體移植則可降低組織mtDNA突變的風(fēng)險，并且技術(shù)不涉及倫理問題，但這對于生物技術(shù)是一項巨大的挑戰(zhàn)，需要進一步的復(fù)雜實驗和使用動物模型來慢慢地建立發(fā)展起來[31]。

綜上所述，線粒體作為重要的能量代謝細(xì)胞器，對卵細(xì)胞成熟、受精及胚胎著床前發(fā)育都具有重要作用。應(yīng)用現(xiàn)有的細(xì)胞生物學(xué)及分子遺傳學(xué)手段，找出合適的線粒體來源供體，結(jié)合卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射，對低質(zhì)量卵細(xì)胞進行有效線粒體移植，可以明顯改善卵細(xì)胞的質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛能，從而開啟因卵巢儲備功能減退而難以生育的治療新篇章。