EZH2及其抑制劑在非小細(xì)胞肺癌研究中的進(jìn)展

宮 顥，劉紅雨，陳 軍，

（1天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院肺部腫瘤外科，2天津市肺癌研究所，天津市肺癌轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境實(shí)驗(yàn)室，天津300052）

0 引言

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其死亡率占全球男性腫瘤患者死亡人數(shù)的28%，女性腫瘤患者死亡人數(shù)的26%，是世界性腫瘤相關(guān)性死亡的首要病因［1］。在我國(guó)，肺癌已成為75歲以上男性患者和60歲以上女性患者的主要死因［2］。其中以鱗癌和腺癌為主的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌總數(shù)的80%以上。盡管外科手術(shù)及放化療等治療手段較之前有了明顯提高，但患者預(yù)后仍較差，5年生存率僅為15%［3］。大約70%的肺癌患者在肺癌切除術(shù)后會(huì)出現(xiàn)不同程度的轉(zhuǎn)移及局部腫瘤復(fù)發(fā)。對(duì)患者進(jìn)行基因檢測(cè)、篩查與預(yù)后相關(guān)的腫瘤分子標(biāo)記物能夠更好地指導(dǎo)臨床用藥，從而延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間［4］。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，研究人員［5-6］發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中除會(huì)出現(xiàn)特定基因位點(diǎn)改變及異常信號(hào)通路激活外，還會(huì)出現(xiàn)一些特殊的表觀遺傳性狀的改變。表觀遺傳調(diào)控是一類重要的調(diào)控機(jī)制，通過(guò)改變所合成蛋白質(zhì)的構(gòu)象影響蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性從而發(fā)揮作用。表觀遺傳調(diào)控在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡，基因的表達(dá)調(diào)控及疾病的進(jìn)展中均扮演重要的角色。常見(jiàn)的表觀遺傳學(xué)修飾包括基因的甲基化、乙?；傲姿峄M蛋白是其重要的修飾位點(diǎn)［5］。Zeste增強(qiáng)子同源物 2（enhancer of zeste homolog 2， EZH2）是一個(gè)重要的表觀遺傳調(diào)控基因，具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（histone methyltransferase， HMT）活性，能夠?qū)M蛋白H3第27位賴氨酸三甲基（H3K27me3）催化從而抑制靶基因的表達(dá)［6］。EZH2基因最早發(fā)現(xiàn)于果蠅的體內(nèi)，是果蠅發(fā)育基因關(guān)鍵抑制性調(diào)節(jié)因子［7］。隨著研究的不斷深入，科研人員發(fā)現(xiàn)在人體內(nèi)同樣也存在EZH2基因，且EZH2的表達(dá)異常與實(shí)體瘤（包括前列腺癌、乳腺癌、腎癌和肺癌）的不良預(yù)后相關(guān)［8］。EZH2基因在NSCLC中高表達(dá)，且表達(dá)水平與患者的預(yù)后密切相關(guān)。許多研究［9-13］也同時(shí)證實(shí)應(yīng)用EZH2抑制劑能夠有效降低NSCLC的侵襲和遷移能力，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，可見(jiàn)EZH2抑制劑具有良好的應(yīng)用前景和臨床價(jià)值。本文就近年來(lái)有關(guān)EZH2在NSCLC腫瘤防治研究中的最新進(jìn)展及EZH2抑制劑的應(yīng)用作一綜述。

1 EZH2基因簡(jiǎn)介

EZH2基因位于人類染色體7q35上，屬于PcG（Polycomb group）家族，是多梳蛋白抑制復(fù)合體2（polycomb repressive complex 2， PRC2）的重要催化活性亞單位，EZH2基因組共覆蓋76 939 bp，包括20個(gè)外顯子和19個(gè)內(nèi)含子［14］。PcG蛋白是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，可以對(duì)染色體進(jìn)行相應(yīng)修飾，并參與基因的表達(dá)調(diào)控，在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、衰老及凋亡等過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，PcG蛋白包括PRC1和PRC2，其中PRC2核心成分包含EZH2、SUZ12（suppresso of zeste 12）和 EED（embryonic ectoderm development），EZH2只有與EED及SUZ12結(jié)合才能發(fā)揮其表觀遺傳修飾作用［15-17］。EZH2基因的N端有3個(gè)高度保守序列（Ⅰ區(qū)，Ⅱ區(qū)，富含半胱氨酸區(qū)）， C 端有一個(gè)由 Su（var）3-9、Enhancer of zeste、Trithorax組成的高度保守的 SET結(jié)構(gòu)域（圖1A）。EZH2的SET結(jié)構(gòu)域具有S-腺苷-L-甲硫氨酸（S-Adenosyl-L-methionine，SAM）及H3組蛋白N端的賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)［6］。帶正電荷的SAM以及帶正電荷賴氨酸尾端的組蛋白與SET結(jié)合后，通過(guò)水介導(dǎo)的去質(zhì)子化反應(yīng)促使H3K27 ε-氨基活化，活化的 H3K27 ε-氨基可以進(jìn)一步與甲基供體SAM反應(yīng)從而生成S-腺苷-L-高半胱氨酸（S-Adenosyl-L-homocysteine，SAH）及H3K27me3（圖1B）。EZH2基因在多種腫瘤包括小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer， SCLC）、NSCLC、前列腺癌、乳腺癌、淋巴瘤等中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤患者的預(yù)后相關(guān)［8］。Xu等［18］臨床研究發(fā)現(xiàn)，在360例臨床Ⅲ期和Ⅳ期肺癌患者中，有204例患者的癌組織EZH2表達(dá)為陽(yáng)性；Kaplan-Meier生存分析曲線結(jié)果顯示，這部分患者的生存時(shí)間要明顯低于EZH2表達(dá)量低的患者，這表明EZH2有望成為評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)腫瘤患者預(yù)后的新型腫瘤分子標(biāo)志物。

圖1 EZH2主要區(qū)域和EZH2介導(dǎo)H3K27三甲基化示意圖

2 EZH2在NSCLC發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用

2.1 調(diào)節(jié)腫瘤血管生成過(guò)程血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factors， VEGF）能夠促使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，改變血管的通透性，是腫瘤生長(zhǎng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［19］。EZH2能夠調(diào)節(jié) VEGF-A／AKT信號(hào)通路從而促進(jìn)NSCLC的生長(zhǎng)。Geng等［20］發(fā)現(xiàn)在NSCLC中，EZH2主要通過(guò)磷脂酰肌醇3激酶／蛋白激酶B（PI3K／AKT）通路來(lái)調(diào)節(jié)VEGF的生物學(xué)活性；在過(guò)表達(dá)EZH2的NSCLC細(xì)胞中，VEGF、磷酸化絲氨酸蛋白激酶 B（phosphorylated Ser473-AKT）會(huì)出現(xiàn)明顯升高；而應(yīng)用EZH2抑制劑或沉默EZH2時(shí)，VEGF及phosphorylated Ser473-AKT均會(huì)受抑制。與此同時(shí)，VEGF也能通過(guò)抑制血管生成負(fù)性調(diào)節(jié)因子的表達(dá)反向上調(diào)EZH2，從而增強(qiáng)血管的生成能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［21］。

2.2 抑制抑癌基因促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及促進(jìn)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，

EMT）EZH2能與組蛋白去乙酰轉(zhuǎn)移酶直接相互作用導(dǎo)致組蛋白去乙酰化，抑制腫瘤細(xì)胞相關(guān)抑制基因的表達(dá)。組織金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）是一種特異性的抑制性基質(zhì)金屬蛋白酶，能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的蛋白水解活性。 TIMP-3是TIMP家族中唯一能與細(xì)胞外基質(zhì)緊密結(jié)合的成員，能抑制腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。Xu等［13］研究發(fā)現(xiàn)在肺癌細(xì)胞中EZH2參與抑制轉(zhuǎn)移抑制基因TIMP-3的轉(zhuǎn)錄，抑制EZH2的表達(dá)能夠顯著提高TIMP-3水平，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。

EMT是指上皮細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程，其在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。EMT主要的表現(xiàn)形式包括：E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)減少；細(xì)胞骨架由角蛋白向波形蛋白轉(zhuǎn)化；細(xì)胞出現(xiàn)間充質(zhì)細(xì)胞的特征等。Jiang等［22］發(fā)現(xiàn)在NSCLC中敲低 EZH2、EED、SUZ12、EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Snail和Slug）和間充質(zhì)標(biāo)記物（波形蛋白、N-鈣粘蛋白、纖連蛋白和PAI-1）的表達(dá)會(huì)出現(xiàn)明顯降低，而E-鈣粘蛋白量明顯增加，即EZH2同樣也參與了NSCLC的EMT轉(zhuǎn)化過(guò)程。

2.3 在肺癌中EZH2與miRNA之間的相互調(diào)控關(guān)系抑制EZH2能夠通過(guò)其對(duì)應(yīng)的miRNA發(fā)揮生物學(xué)功能。MiRNA是一種內(nèi)源性小分子非編碼RNA，由19～22個(gè)核苷酸組成，在細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)和凋亡中起著十分重要的作用，其主要通過(guò)直接與靶基因3′端相對(duì)應(yīng)mRNA配對(duì)，從而導(dǎo)致mRNA降解及蛋白翻譯抑制，miRNA也同時(shí)參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程［23］。 Jiang 等［22］發(fā)現(xiàn)在 NSCLC 中，EZH2 是 mir-26a下游的靶點(diǎn)，且EZH2的表達(dá)與mir-26a呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，同時(shí)，mir-26a的下調(diào)能導(dǎo)致肺癌細(xì)胞對(duì)于鉑類化合物的耐藥，抑制EZH2可以通過(guò)上調(diào)mir-26a逆轉(zhuǎn)鉑類耐藥；Sun等［24］研究結(jié)果顯示 miR-4465在NSCLC細(xì)胞中下調(diào)，且miR-4465能夠抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，miR-4465是通過(guò)抑制EZH2進(jìn)而發(fā)揮其腫瘤抑制的作用。

2.4 抑制NSCLC細(xì)胞凋亡PUMA基因又稱為p53上調(diào)凋亡調(diào)制物（p53 upregulated modulator of apoptosis），能被p53迅速誘導(dǎo)從而產(chǎn)生強(qiáng)大的促細(xì)胞凋亡作用。PUMA蛋白屬于Bcl-2蛋白家族中的BH3-only家族，由193個(gè)氨基酸殘基組成，主要結(jié)構(gòu)包括BH3結(jié)構(gòu)域C末端跨膜結(jié)構(gòu)域及N末端絲氨酸10號(hào)位磷酸化修飾位點(diǎn)三個(gè)部分［25］。PUMA可以通過(guò)BH3結(jié)構(gòu)域與Bax的第一個(gè)α螺旋發(fā)生相互作用從而與凋亡效應(yīng)蛋白Bax結(jié)合，直接活化Bax／Bak，產(chǎn)生細(xì)胞凋亡的作用。當(dāng)各種病理因素積累時(shí)，PUMA基因會(huì)通過(guò)p53依賴通路或非依賴通路發(fā)揮促凋亡作用。Liu等［15］研究發(fā)現(xiàn)EZH2基因可以抑制Bax／Bak的信號(hào)通路從而進(jìn)一步抑制腫瘤的凋亡。Follis等［25］的研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC中抑制EZH2基因表達(dá)能夠明顯上調(diào)PUMA，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

3 EZH2抑制劑的功能及應(yīng)用

基于EZH2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，研究人員已經(jīng)研制出多種EZH2抑制劑并對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的體外實(shí)驗(yàn)及臨床研究。圖2總結(jié)了較為常用的EZH2抑制劑及其化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

圖2 不同EZH2抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

3.1 EZH2抑制劑的作用原理圖3總結(jié)了兩種常見(jiàn)EZH2抑制劑的作用原理。常用的EZH2抑制劑包括兩類。一類為SAH水解酶抑制劑，其能阻斷SAH水解為同型半胱氨酸及腺苷過(guò)程，達(dá)到間接抑制甲硫氨酸循環(huán)的目的，從而抑制SAM再生，最終通過(guò)旁路途徑消耗EZH2及相關(guān)H3K27-me3，具有代表性的是DZNep（圖2A）。DZNep是最早研制的EZH2抑制劑，能夠?qū)е耂AH升高，間接抑制H3K27三甲基化的發(fā)生，誘導(dǎo) EZH2、SUZ12、EED和 H3K27me3的降解［26］。另一類抑制劑則是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制SAM發(fā)揮作用，抑制劑與SAM共同競(jìng)爭(zhēng)在H3K27上的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致SAM數(shù)量減少，SAM依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶受抑制，正常H3K27不能發(fā)生三甲基化反應(yīng)，具有代表性的是 GSK126（圖2B）、GSK343（圖 2C）及EPZ005687（圖2D）。隨著藥物研究的進(jìn)一步發(fā)展，新型的 EZH2抑制劑——Tazemetostat（圖 2E）和CPI169（圖2F）也相繼被研發(fā)出來(lái)。

圖3 EZH2抑制劑作用示意圖

3.2 EZH2抑制劑能夠提升腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性EZH2抑制劑能夠提升腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性，增強(qiáng)藥物的療效。在SCLC中，EZH2在腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的獲得性耐藥過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。Gardner等［27］發(fā)現(xiàn)，化療藥物能夠通過(guò)EZH2的轉(zhuǎn)甲基作用導(dǎo)致H3K27me3在SLFN11基因上聚集，從而導(dǎo)致該基因部分染色質(zhì)凝聚，抑制其表達(dá)。而在NSCLC中，應(yīng)用EZH2抑制劑能夠有效地提升具有BRG1和EGFR突變的NSCLC細(xì)胞對(duì)依托泊苷的敏感性［28］；抑制EZH2的表達(dá)能夠有效逆轉(zhuǎn)NSCLC對(duì)于鉑類化療藥物的耐藥性［15］；聯(lián)合應(yīng)用DZNep與組蛋白去乙酰酶抑制劑諾夫立他能夠顯著抑制NSCLC的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［26］。而在肝癌細(xì)胞中，應(yīng)用EZH2抑制劑能夠提升癌細(xì)胞對(duì)索拉西尼的敏感性［25］。

4 EZH2抑制劑最新相關(guān)臨床試驗(yàn)

在動(dòng)物體內(nèi)應(yīng)用EZH2抑制劑或應(yīng)用EZH2與其他藥物配伍，能夠有效地減少腫瘤細(xì)胞的體積，而較對(duì)照組小鼠，體質(zhì)量變化并不十分明顯，且沒(méi)有出現(xiàn)明顯其他組織器官轉(zhuǎn)移，可見(jiàn)在動(dòng)物體內(nèi)應(yīng)用EZH2抑制劑 GSK2816126安全性相對(duì)較高［15，18，25-26］。 在復(fù)發(fā) ／難治性彌漫性大 B 細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma， DLBCL）、其他非霍奇金淋巴瘤（non-hodgkin's lyrnphoma，NHL）、轉(zhuǎn)化性濾泡性淋巴瘤（transformed follicular lymphoma，TFL），實(shí)體瘤和多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）中已經(jīng)完成了1期的臨床試驗(yàn)，共有30例患者接受了EZH2抑制劑治療，其中10例為DLBCL，2例為TFL，2例為其他類型NHL（濾泡性淋巴瘤和邊緣區(qū)淋巴瘤）和16例實(shí)體瘤，初步結(jié)果表明GSK2816126耐受性良好，沒(méi)有觀察到劑量限制性毒性（dose-limiting toxicity，DLT），最終在22名可評(píng)估的患者中，晚期生發(fā)中心來(lái)源的淋巴瘤（germinal center B-cell-like，GCB）及DLBCL的患者中觀察到1位患者出現(xiàn)PR，7例患者病情穩(wěn)定［29］?；贓ZH2抑制劑的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究者已經(jīng)將EZH2抑制劑應(yīng)用于臨床試驗(yàn)階段，表1總結(jié)了近5年來(lái)EZH2抑制劑的相關(guān)臨床試驗(yàn)。目前為止絕大多數(shù)的臨床試驗(yàn)都是將EZH2抑制劑應(yīng)用于血液系統(tǒng)腫瘤中，但值得關(guān)注的是，在2018年 3月 Pfizer公司將新一代 EZH2抑制劑PF-06821497應(yīng)用于SCLC的Ⅰ期實(shí)驗(yàn)中。SCLC與NSCLC具有一定的相同點(diǎn)，腫瘤細(xì)胞的EZH2表達(dá)量明顯高于正常肺組織，且應(yīng)用EZH2抑制劑均能促使兩種腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞周期，并能提升腫瘤細(xì)胞對(duì)于鉑類藥物的敏感性。但不同的是，SCLC對(duì)放化療更敏感，應(yīng)用EZH2抑制劑對(duì)于腫瘤細(xì)胞的殺傷能力會(huì)更強(qiáng)；且對(duì)于miRNA的互調(diào)作用方面，兩種細(xì)胞對(duì)應(yīng)的miRNA并不相同。但截至目前絕大多數(shù)臨床試驗(yàn)處于志愿者招募或數(shù)據(jù)匯總階段，還沒(méi)有最新的臨床試驗(yàn)結(jié)果匯報(bào)，但其結(jié)果拭目可待。

5 展望

NSCLC目前仍在威脅人類健康，盡管對(duì)其的治療手段與種類較之前有了明顯的豐富和提高，但患者預(yù)后并未得到顯著的改善，5年生存率仍相對(duì)較低。最新研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中除了會(huì)出現(xiàn)特定基因的改變外，還存在特殊的表觀遺傳學(xué)的改變。作為表觀遺傳學(xué)調(diào)控的核心分子，EZH2在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥中發(fā)揮著重要作用。EZH2抑制劑能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制細(xì)胞周期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物治療的敏感性，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，有望給NSCLC帶來(lái)新的突破口。截至目前，EZH2抑制劑仍處在臨床試驗(yàn)的階段，但就其在體外及動(dòng)物體內(nèi)的研究結(jié)果來(lái)看，其未來(lái)在肺癌中的治療前景十分廣闊。

表1 不同EZH2抑制劑的臨床試驗(yàn)總結(jié)