新生大鼠松果體細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及增殖情況觀察

韓星 馮星

【摘要】 目的：分離培養(yǎng)并鑒定新生大鼠松果體細(xì)胞，觀察其體外增殖情況。方法：選擇30只新生SD大鼠，處死后分離松果體組織，采用多聚賴氨酸對(duì)培養(yǎng)板予預(yù)包被處理胰酶消化、經(jīng)差速貼壁分離等方法，對(duì)新生大鼠松果體細(xì)胞進(jìn)行體外分離培養(yǎng)并傳代。觀察50 d內(nèi)體外培養(yǎng)的松果體細(xì)胞的形態(tài)變化，培養(yǎng)7 d時(shí)采用免疫熒光法，觀察原代松果體細(xì)胞5-羥色胺（5-HT）及微管相關(guān)蛋白-2（MAP-2），實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶（AANAT）及生長(zhǎng)抑素（SS）mRNA。分別取傳代第1、3、5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞增殖情況。結(jié)果：新生大鼠松果體細(xì)胞呈圓球形或多角形，培養(yǎng)21 d時(shí)松果體細(xì)胞體積明顯增大，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)深色細(xì)小囊泡狀顆粒。培養(yǎng)7、14、21、28 d時(shí)，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，松果體細(xì)胞AANAT mRNA的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低（P<0.05），松果體細(xì)胞SS mRNA的相對(duì)表達(dá)量先升高后降低（P<0.05）。細(xì)胞傳代后第1、3代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線近似“S”形，且第3代細(xì)胞增殖最為旺盛;隨傳代次數(shù)增加，第5代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線近似平緩，細(xì)胞逐漸衰老、死亡。結(jié)論：采用胰酶消化、差速貼壁分離等方法并結(jié)合含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，可獲得純度較高且有增殖潛力的大鼠松果體細(xì)胞，細(xì)胞在體外增殖活躍，且具有一定的生物學(xué)功能。

【關(guān)鍵詞】 松果體細(xì)胞 五羥色胺 微管相關(guān)蛋白-2 N-乙?；D(zhuǎn)移酶 生長(zhǎng)抑素 細(xì)胞增殖

[Abstract] Objective： To isolate， culture and identify the pineal cells of newborn rats and observe their proliferation in vitro. Method： A total of 30 newborn SD rats were selected， the pineal tissue was separated after death， the pineal cells of newborn rats were cultured and subcultured in vitro by the methods of trypsin digestion and separation by differential attachment. The morphological changes of pineal cells cultured in vitro within 50 days were observed， after 7 days of culture， 5-hydroxytryptamine （5-HT） and microtubule associated protein-2 （MAP-2） were observed by immunofluorescence， the mRNA of N-acetyltransferase （AANAT） and somatostatin （SS） were detected by real-time quantitative PCR. The first， third and fifth generations of logarithmic growth cells were collected and the cell proliferation was measured. Result： The pineal cells of the newborn rats were round or polygonal， after 21 days of culture， the volume of pineal cells increased significantly， and dark vesicular granules were seen in the cytoplasm. At the 7th， 14th， 21st and 28th day of culture， with the prolongation of culture time， the relative expression of AANAT mRNA decreased gradually （P<0.05）， and the relative expression of SS mRNA increased first and then decreased （P<0.05）. The growth curve of the first and third generation cells was similar to “S” shape， and the third generation cells had the most vigorous proliferation， with the increase of subculture times， the growth curve of the fifth generation of cells was almost smooth， and the cells gradually aged and died. Conclusion： By using trypsin digestion， differential attachment separation and DMEM/F12 medium containing 10% fetal bovine serum， rat pineal cells with high purity and potential for proliferation can be obtained. The cells proliferate actively in vitro and have certain biological functions.

[Key words] Pineal gland cells 5-HT MAP-2 AANAT SS Cell multiplication

First-authors address： Childrens Hospital of Soochow University， Suzhou 215000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.36.007

松果體是哺乳動(dòng)物的主要神經(jīng)內(nèi)分泌器官，可作為中樞晝夜節(jié)律振蕩器的同時(shí)合成吲哚類(lèi)和多肽類(lèi)激素。褪黑素（MT）是松果體的主要分泌物，對(duì)許多器官功能具有高度的整合調(diào)節(jié)作用;5-羥色胺（5-HT）是松果體細(xì)胞合成MT的中間產(chǎn)物，N-乙?；D(zhuǎn)移酶（AANAT）是一種MT限速酶，可抑制松果體細(xì)胞表達(dá)MT。微管相關(guān)蛋白-2（MAP-2）是神經(jīng)元細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白，主要存在于神經(jīng)元胞體和樹(shù)突。生長(zhǎng)抑素（SS）是一種神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。既往研究曾采用哺乳類(lèi)動(dòng)物、鳥(niǎo)、魚(yú)類(lèi)的松果體器官、組織來(lái)研究松果體的形態(tài)和功能[1-4]。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是目前的研究熱點(diǎn)[5-6]。建立一種簡(jiǎn)單、快速、有效的松果體細(xì)胞培養(yǎng)方法，獲得高存活率及高生物活性的松果體細(xì)胞仍是目前細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵。筆者采用相關(guān)方法對(duì)新生大鼠松果體細(xì)胞進(jìn)行體外分離培養(yǎng)，并作鑒定?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料選擇 出生時(shí)間<24 h的正常清潔級(jí)SD大鼠30只，雌雄不限，體重5～6 g，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。DMEM/F12培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、鏈霉素以及青霉素均由美國(guó)Gibco公司所提供;美國(guó)Sigma公司提供多聚賴氨酸、胰蛋白酶以及阿糖胞苷;CCK-8購(gòu)自上海東仁化學(xué)科技有限公司;PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 大鼠松果體細(xì)胞體外分離培養(yǎng)鑒定方法

1.2.1 取材 30只健康的新生SD大鼠均實(shí)行頸椎脫臼法將其處死，隨后利用75%乙醇進(jìn)行徹底消毒，并將大鼠全部固定在實(shí)驗(yàn)操作板上，確保整個(gè)操作過(guò)程處于無(wú)菌環(huán)境下，經(jīng)其顱骨骨片向前掀開(kāi)，游離粘連于顱骨上的松果體，利用顯微手術(shù)鑷剝除血管以及外膜，隨后將其放置在冷PBS加DMEM高糖培養(yǎng)基等體積混合液的EP管中留以備用。

1.2.2 胰酶消化分離培養(yǎng) 根據(jù)情況提取適量的松果體組織，隨后實(shí)行冷PBS洗滌，并加入劑量為1 mL的0.25%胰蛋白酶，隨后將其放置溫度為37 ℃的保溫箱中進(jìn)行消化，消化時(shí)間控制為20 min，并輕吹1 min，將細(xì)胞吹散。隨后將液體轉(zhuǎn)至劑量為15 mL的離心管內(nèi)，并用相同體積的FBS以此來(lái)終止消化，經(jīng)1 000 r/min離心處理，棄上清，加入8 mL含10%的FBS、1%青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行輕輕吹打，重懸細(xì)胞，嚴(yán)格按照按5×105/mL的細(xì)胞密度比例接種于多聚賴氨酸包被過(guò)夜的6孔培養(yǎng)板，讓其處于靜置狀態(tài)，并培養(yǎng)于體積分?jǐn)?shù)5% CO2，溫度37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 松果體原代細(xì)胞分離純化及傳代培養(yǎng) 按照松果體細(xì)胞貼壁與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)間不同的原理分別實(shí)行差速分離。提取并培養(yǎng)1周的分離細(xì)胞生長(zhǎng)至90%培養(yǎng)板的時(shí)候，利用PBS反復(fù)清洗2次，隨后采用0.25%胰蛋白酶加以消化。隨后在顯微鏡的指引下對(duì)消化情況進(jìn)行觀察，倘若細(xì)胞由緊密貼壁的形態(tài)漸漸轉(zhuǎn)改變?yōu)閳A形懸浮狀態(tài)，則予等體積FBS終止消化，隨后抽取細(xì)胞懸液15 mL，實(shí)行離心以后再棄上清，將細(xì)胞懸液進(jìn)行重新調(diào)配，隨后將其放置于專(zhuān)門(mén)的培養(yǎng)箱中，將培養(yǎng)時(shí)間控制為15 min，吸取未貼壁的細(xì)胞懸液重新接種于25 mL培養(yǎng)瓶，經(jīng)過(guò)12 h的培養(yǎng)，加入阿糖胞苷2.5 μg/mL，隨后培養(yǎng)2 d后將溶液重新?lián)Q掉。培養(yǎng)7 d后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶的90%左右以后，按照1︰3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，第2天再將半量更換培養(yǎng)基，隨后按照規(guī)定的時(shí)間進(jìn)行觀察。

1.2.4 大鼠松果體細(xì)胞鑒定 間隔1 d后利用倒置顯微鏡來(lái)查看體外松果體細(xì)胞整體的變化情況。隨后抽取經(jīng)過(guò)培養(yǎng)1周的原代松果體細(xì)胞，嚴(yán)格按照免疫熒光法進(jìn)行5-HT、MAP-2鑒定。利用室溫PBS反復(fù)輕輕漂洗3次，5 min/次，再經(jīng)室溫4%多聚甲醛中固定0.5 h，控制室溫讓其晾干，PBS反復(fù)清洗3次，10 min/次，0.1% Triton-100浸潤(rùn)10 min，PBS反復(fù)清洗3次，10 min/次，隨后在每個(gè)孔注入劑量為200 μL的FBS，將其在室溫封閉至少1 h，隨后棄去血清，并將1︰100的兔抗鼠5-HT（Ⅰ抗）200 μL將入其中，放置于溫度為4 ℃的室內(nèi)過(guò)夜，PBS反復(fù)清洗3次，10 min/次;最后將1︰500 FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG（Ⅱ抗）200 μL加入其中，放置于背光的室溫內(nèi)進(jìn)行1 h的孵育，PBS反復(fù)清洗3次，5 min/次;隨后進(jìn)行DAPI染核（1︰2 000），放置于背光的室溫內(nèi)進(jìn)行2 min的孵育;最后做同型對(duì)照，不加Ⅰ抗，余步驟同前，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察松果體細(xì)胞5-HT、MAP-2。分別取培養(yǎng)7、14、21、28 d的松果體細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cRNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定大鼠松果體細(xì)胞中AANAT及SS mRNA。以GADPH為內(nèi)參，根據(jù)GenBank中調(diào)取的大鼠AANAT、SS和GADPH完整cDNA序列，利用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)PCR引物，PCR引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，SYBR Green PCR minasterMix 20 μL，AANAT、SS和GAPDH上下游引物各1 μL，反應(yīng)總體積20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)熱、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，72 ℃、30 s，72 ℃收集熒光，共45個(gè)循環(huán)。運(yùn)用LightCyler 480軟件進(jìn)行實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)收集和定量分析，采用公式2-ΔΔCt法計(jì)算各樣本中AANAT及SS mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 大鼠松果體細(xì)胞體外增殖情況觀察 根據(jù)CCK8法，將傳代第1、3、5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分別取出，隨后分別以1×105/孔的細(xì)胞密度接種在的96孔板內(nèi)，每代為21個(gè)復(fù)孔。在每個(gè)孔內(nèi)均注入劑量為100 μL的細(xì)胞培養(yǎng)液，隨后將其放置于溫度為37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中加以培養(yǎng)。加入10 μL CCK-8溶液后于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h。以只加入細(xì)胞培養(yǎng)液不加入細(xì)胞的空白孔為平行對(duì)照孔，最后比色時(shí)，以空白孔調(diào)零。用酶標(biāo)儀測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)傳代第1、3、5代松果體細(xì)胞450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值（A450），3孔/d，連續(xù)測(cè)7 d。以培養(yǎng)時(shí)間（d）為橫坐標(biāo)，A450值為縱坐標(biāo)繪制傳代第1、3、5代松果體細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，多組間比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠松果體細(xì)胞形態(tài) 原代松果體細(xì)胞主要以懸浮狀態(tài)，而外形則以圓球形為主，當(dāng)實(shí)行接種以后的15 min便會(huì)貼壁，絕大部分的細(xì)胞在經(jīng)過(guò)1 d的培養(yǎng)后便會(huì)完成貼壁，發(fā)生貼壁后細(xì)胞主要以多角形或者是圓球形呈現(xiàn)，貼附于成纖維細(xì)胞層上方并且保持散在形勢(shì)不斷生長(zhǎng)，在培養(yǎng)的整個(gè)流程中會(huì)伴隨著細(xì)胞的分裂而不斷地聚集生長(zhǎng)。當(dāng)培養(yǎng)21 d以后，其松果體細(xì)胞的體積會(huì)發(fā)生顯著增大，并且能夠在胞漿內(nèi)觀察到深色的細(xì)小囊泡狀顆粒，后期生長(zhǎng)極為旺盛，不斷分裂且活躍。經(jīng)過(guò)50 d的培養(yǎng)，松果體細(xì)胞便不會(huì)再增殖，細(xì)胞則會(huì)呈現(xiàn)脫落以及死亡狀態(tài)，僅僅能夠成膠質(zhì)細(xì)胞或者是纖維細(xì)胞才能存活。

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠松果體細(xì)胞AANAT及SS mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較 培養(yǎng)7、14、21、28 d時(shí)，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，松果體細(xì)胞AANAT mRNA的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低（P<0.05），松果體細(xì)胞SS mRNA的相對(duì)表達(dá)量先升高后降低（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 大鼠松果體細(xì)胞體外增殖情況 第1、3代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線近似“S”形，第1、3代細(xì)胞接種2～3 d后，細(xì)胞數(shù)量增多，第3、4天為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，5 d后細(xì)胞數(shù)平穩(wěn)無(wú)明顯增加;第5代細(xì)胞接種后生長(zhǎng)曲線近似平緩，A450值無(wú)明顯變化，細(xì)胞數(shù)增加不明顯，無(wú)明顯對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。見(jiàn)表3、圖1。

3 討論

松果體細(xì)胞體外培養(yǎng)可以去除體液因素以及神經(jīng)對(duì)松果體的作用，可作為研究其自身分泌功能、特性以及合成重要方法。然而在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的整個(gè)過(guò)程中會(huì)面臨細(xì)胞不易傳代、不純以及生長(zhǎng)緩慢等一系列問(wèn)題，所以，采用成功以及簡(jiǎn)便的方式來(lái)獲得純度高且極為穩(wěn)定的松果體細(xì)胞至關(guān)重要。

本研究使用新生大鼠松果體作為細(xì)胞培養(yǎng)的組織來(lái)源[7]，因新生大鼠松果體常粘于顱頂骨，易于剝離，不易污染，且組織較軟，游離后易消化、離心等。培養(yǎng)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)使用出生24 h內(nèi)新生大鼠松果體較生后10 d大鼠松果體培養(yǎng)效果好，考慮與新生大鼠松果體細(xì)胞較好的增殖及分化潛能有關(guān)。游離松果體后剝離外膜及血管，利于得到較純的松果體細(xì)胞，且將游離松果體置于裝有DMEM高糖的培養(yǎng)基中利于消化、分離后細(xì)胞的存活;松果體組織本身質(zhì)地較軟，易于消化，胰酶消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，吹打輕柔均可減少細(xì)胞在操作過(guò)程中的損傷;此外，本研究所采用的多聚賴氨酸對(duì)培養(yǎng)板進(jìn)行預(yù)包被，具有一定促進(jìn)松果體貼壁的重要價(jià)值作用，可顯著縮短松果體細(xì)胞貼壁的整體時(shí)間，讓細(xì)胞能夠繼續(xù)生長(zhǎng)。當(dāng)松果體細(xì)胞處于含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中的時(shí)候，能夠促使其良好的增殖下去[8-9]，當(dāng)培養(yǎng)7 d左右，可按照阿糖胞苷以及差速貼壁的方法對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)起到一定的抑制作用，以此來(lái)確保純化松果體細(xì)胞同時(shí)傳代培養(yǎng)，同時(shí)注意阿糖胞苷濃度不易過(guò)高，否則會(huì)抑制松果體細(xì)胞的生長(zhǎng)[10]。以上方法可以為松果體細(xì)胞體外培養(yǎng)創(chuàng)造適宜的環(huán)境，為進(jìn)一步探討其生物學(xué)功能的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。針對(duì)松果體細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行研究，能夠?qū)ιL(zhǎng)特征有一個(gè)深度的認(rèn)識(shí)。本實(shí)驗(yàn)使用CCK-8測(cè)量細(xì)胞相對(duì)的A450值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，能夠清晰地反映出細(xì)胞的增殖狀況，其中第1、3代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線近似“S”形，可見(jiàn)其增殖的狀況較好，針對(duì)松果體細(xì)胞體外可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)，而第5代細(xì)胞接種后生長(zhǎng)曲線近似平緩，吸光度無(wú)明顯變化，細(xì)胞數(shù)增加不明顯，無(wú)明顯對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。所以松果體細(xì)胞在體外培養(yǎng)傳代的次數(shù)有一定限制的，同時(shí)傳代3代內(nèi)的細(xì)胞更適合實(shí)驗(yàn)。

在體外培養(yǎng)條件下可以分化為多種類(lèi)型的細(xì)胞，包括幾種類(lèi)型的光感受細(xì)胞，如5-HT能神經(jīng)元，HPC-1陽(yáng)性的神經(jīng)元等，根據(jù)體外培養(yǎng)后多種分化潛能可用多種方法進(jìn)行鑒定[8]，S-antigen是位于松果體細(xì)胞內(nèi)的光感受特殊蛋白，對(duì)松果體細(xì)胞也有較好的鑒別效果，GABA、神經(jīng)特殊抗原（HPC-1）以及MAP-2等一系列抗體聯(lián)同突觸膜蛋白經(jīng)過(guò)免疫組化已定位在培養(yǎng)的大鼠松果體細(xì)胞[8-10]，均能夠證明神經(jīng)化學(xué)的特征。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用免疫熒光染色對(duì)5-HT進(jìn)行鑒定，由于5-HT屬于褪黑素構(gòu)成的一種中間產(chǎn)物，既可鑒定，同時(shí)還能對(duì)松果體細(xì)胞的功能進(jìn)行初步判斷;利用MAP-2做免疫熒光鑒定，表明體外培養(yǎng)的松果體細(xì)胞不僅僅擁有內(nèi)分泌功能，并且存在神經(jīng)元特性[11-12]。

AANAT為褪黑素合成的限速酶，在體內(nèi)由松果體內(nèi)的交感神經(jīng)終末釋放去甲腎上腺素及腎上腺素，使松果體細(xì)胞內(nèi)的AANAT活性增加，最終導(dǎo)致MT生成增加[13]。AANAT作為神經(jīng)內(nèi)分泌傳感器分子在合成及調(diào)節(jié)褪黑素方面非常特殊及重要[14]。體外培養(yǎng)的松果體細(xì)胞的AANAT表達(dá)水平可以間接反映細(xì)胞MT的分泌水平。本研究體外培養(yǎng)的松果體細(xì)胞在培養(yǎng)第1周AANAT mRNA表達(dá)水平較高，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，AANAT mRNA表達(dá)水平逐漸減低（P<0.05），考慮原因?yàn)樗晒w細(xì)胞脫離機(jī)體，缺少了交感神經(jīng)終末釋放的去甲腎上腺素的調(diào)節(jié)作用，AANAT的表達(dá)水平逐漸降低[15-16]。松果體除分泌MT等胺類(lèi)激素外，還分泌多種肽類(lèi)物質(zhì)，如SS等。SS是一種神經(jīng)調(diào)節(jié)多肽，在神經(jīng)內(nèi)分泌平衡中起復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用，并與學(xué)習(xí)記憶活動(dòng)有關(guān)[17]，主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)中，其他如內(nèi)分泌系統(tǒng)的松果體等也有分布[18]。文獻(xiàn)[19]采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)到大鼠松果體培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)SS mRNA，并推測(cè)這種多肽以旁分泌的作用形式調(diào)節(jié)松果體細(xì)胞的特征形成。本研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的大鼠松果體細(xì)胞可表達(dá)SS mRNA，且于培養(yǎng)第3周表達(dá)量最高，與松果體細(xì)胞自身增殖的水平高低一致，考慮SS的確以旁分泌的方式來(lái)調(diào)節(jié)自身細(xì)胞的生長(zhǎng)。

綜上所述，本研究以多聚賴氨酸對(duì)培養(yǎng)皿預(yù)包被，胰酶消化、差速貼壁分離、阿糖胞苷抑制膠原細(xì)胞生長(zhǎng)等方法可獲得純度較高的大鼠松果體細(xì)胞，通過(guò)生長(zhǎng)曲線的測(cè)定證明了其可體外傳代培養(yǎng)，但傳代次數(shù)有限，5-HT及MAP-2可較好的鑒別松果體細(xì)胞，且體外培養(yǎng)的細(xì)胞具有一定的生物學(xué)功能，可以作為有用的體外模型來(lái)進(jìn)一步研究生物節(jié)律及內(nèi)分泌系統(tǒng)。

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（收稿日期：2019-09-24） （本文編輯：董悅）