蠐螬多糖組分HDPS-2Ⅱ的理化性質(zhì)及對肝癌的抑制作用

郝曉偉，靖 會，李 萍，張 甜，周四元，李小強(qiáng)，曹 蔚，*

(1.國家中醫(yī)藥管理局中藥胃腸藥理重點(diǎn)研究室，西安 710032； 2.空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系，西安 710032； 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，陜西省天然產(chǎn)物化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，楊凌 712100)

研究發(fā)現(xiàn)，糖類成分在抗氧化[1-2]、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[3-4]、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[5-6]和炎癥的發(fā)生[7]等方面發(fā)揮著重要作用。中藥多糖尤其是動物多糖，結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，活性更廣泛[8-9]。

蠐螬是朝鮮黑金龜子HolotrichiadiomphaliaBates及同屬近緣昆蟲的幼蟲[10]，具有破血、行瘀、通乳等多種藥理作用，主治淤痛、痛風(fēng)、破傷風(fēng)和喉痹等[11]?，F(xiàn)有研究表明，蠐螬提取物可抑制腫瘤生長[12-13]。本實(shí)驗(yàn)用蠐螬提取的總多糖和分離純化的均一性多糖組分HDPS-2Ⅱ進(jìn)行體內(nèi)、體外抗腫瘤活性研究，探討其對肝癌的抑制作用。

1 儀器與材料

1.1儀器 FD-1型冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；自動部份收集器，恒流泵(滬西分析儀器廠)；電熱套(泰斯特儀器公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；離心機(jī)(安亭科學(xué)儀器廠)；SHB-Ⅲ型真空泵(城科工貿(mào)公司)；酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司)；倒置顯微鏡(Nikon公司)。

1.2試藥 蠐螬購于陜西韓城，由陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院鑒定；環(huán)磷酰胺(上海華聯(lián)制藥有限公司)；DEAE-Sephadex A-25、Sephadex G-75和Sephadex G-100凝膠(GE Healthcare 公司)；DMEM高糖培養(yǎng)液(Hyclone公司)；胎牛血清(Gibico公司)；SABC 免疫組織化學(xué)檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；CD34單克隆抗體(Abcam公司)。

1.3動物與瘤株 ICR小鼠48只，雄性，體質(zhì)量18～22 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供；小鼠腹水型肝癌細(xì)胞株H22由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供；肝癌細(xì)胞株HCCLM3和SMMC-7721購自北京北納生物有限公司；HepG2為本實(shí)驗(yàn)室傳代保株。

2 方法

2.1蠐螬多糖的提取和分級制備 將干燥蠐螬粉碎，用4倍體積的無水乙醇提取2 h，重復(fù)3次。蠐螬殘?jiān)?倍量的氫氧化鈉溶液提取2 h，3次。所得提取液合并過濾后減壓濃縮，置于4 ℃ 冷庫中預(yù)冷12 h，無水乙醇沉淀12 h后離心，蒸餾水溶解沉淀，反復(fù)凍融除蛋白，離心收集上清液，透析，減壓濃縮，冷凍干燥，氧化脫色素，得蠐螬總多糖粉末HDPS。

稱取HDPS粉末8 g，溶于160 mL雙蒸水中，0.45 μm濾膜過濾，濾液上樣到DEAE-Sephadex A-25凝膠層析柱，梯度氯化鈉溶液(依次為0，0.5，1.0，2.0和3.0 mol·L-1)洗脫，經(jīng)苯酚-硫酸法[14]檢測，根據(jù)洗脫曲線主峰位置合并收集液，透析脫鹽，減壓濃縮，冷凍干燥，得到蠐螬多糖均一性組分HDPS-1、HDPS-2、HDPS-3和HDPS-4。

組分HDPS-2用雙蒸水配制成質(zhì)量濃度為50 g·L-1的溶液，0.45 μm濾膜過濾，上樣至Sephadex G-100凝膠柱純化，以蒸餾水洗脫，以5 mL·管-1收集洗脫液，苯酚-硫酸法測定，根據(jù)繪制洗脫曲線合并相同峰位的收集液，透析，濃縮，冷凍干燥。再用Sephadex G-75凝膠柱進(jìn)一步純化，透析，濃縮，冷凍干燥，得到蠐螬均一性多糖組分HDPS-2Ⅱ。

2.2HDPS-2Ⅱ理化性質(zhì)的鑒定 用HPSEC法測定HDPS-2Ⅱ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和相對分子質(zhì)量：分別配制質(zhì)量濃度為10 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖Dextran T-5、T-12、T-50、T-150、T-410、藍(lán)色葡聚糖2 000 000及葡萄糖，高速離心；同法制備HDPS-2Ⅱ樣品，10 μL進(jìn)樣。按照色譜條件檢測：Shodex SB-804和SB-803HQ串聯(lián)柱；流動相為0.1 mol·L-1的硫酸鈉水溶液；流速為0.8 mL·min-1；柱溫為25 ℃。以標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的分配系數(shù)Kav為橫坐標(biāo)(x1)、對照品相對分子質(zhì)量對數(shù)值lgM(M指各標(biāo)準(zhǔn)糖的相對分子質(zhì)量，單位是Da)為縱坐標(biāo)(y1)，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算HDPS-2Ⅱ的相對分子質(zhì)量。

根據(jù)考馬斯亮藍(lán)法[15]，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，測定HDPS-2Ⅱ的蛋白質(zhì)含量；根據(jù)硫酸-咔唑法[16]，以半乳糖醛酸作為標(biāo)準(zhǔn)，測定HDPS-2Ⅱ的糖醛酸含量；根據(jù)硫酸鋇比濁法[17]，測定HDPS-2Ⅱ硫酸基含量；根據(jù)半胱氨酸-硫酸法[18]，測定HDPS-2Ⅱ中氨基的含量。

2.3MTT體外抗腫瘤活性研究 參照MTT法[19]，設(shè)置空白組、對照組和不同質(zhì)量濃度給藥組(使藥物終質(zhì)量濃度為3～300 mg·L-1)，測定多糖體外抗腫瘤活性。細(xì)胞增殖率=(A給藥組-A空白組)÷(A對照組-A空白組)×100%。

2.4肝癌細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將HepG2細(xì)胞接種于24孔板中，每孔5×105個，培養(yǎng)過夜，用10 μL槍頭在培養(yǎng)板底部劃痕，用PBS緩沖液沖洗干凈劃掉的細(xì)胞。每孔加入不同質(zhì)量濃度的多糖無血清培養(yǎng)液500 μL，培養(yǎng)0和48 h 后拍照觀察遷移距離。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5H22肝癌移植瘤小鼠模型的建立及分組 抽取H22腹水型肝癌細(xì)胞株，用預(yù)冷的生理鹽水清洗3次，并調(diào)整密度至1×107個· mL-1，以0.2 mL接種于小鼠右后背部，24 h后將小鼠隨機(jī)分成6組：對照組(9 g·L-1氯化鈉溶液)、CTX組(腹腔注射CTX 20 mg·kg-1)、HDPS組(腹腔注射HDPS 20 mg·kg-1)和HDPS-2Ⅱ 3個劑量組(高劑量組腹腔注射HDPS-2Ⅱ50 mg·kg-1，中劑量組腹腔注射HDPS-2Ⅱ 20 mg·kg-1，低劑量組腹腔注射HDPS-2Ⅱ 10 mg·kg-1)，每組8只。每日稱定質(zhì)量后，腹腔注射給藥。14 d后稱定小鼠質(zhì)量，眼眶取血，處死動物，取皮下瘤、胸腺和脾臟，分別稱定質(zhì)量。抑瘤率=(對照組瘤質(zhì)量-給藥組瘤質(zhì)量)÷對照組瘤質(zhì)量×100%；臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量÷體質(zhì)量。

2.6蠐螬多糖對荷瘤小鼠外周血白細(xì)胞(WBC)和淋巴細(xì)胞的影響 小鼠給藥 14 d后眼眶取血，用全自動血細(xì)胞分析儀檢測白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量。

2.7組織病理形態(tài)學(xué)觀察 用質(zhì)量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛固定小鼠移植瘤，制備5 μm石蠟片，HE染色。觀察各組腫瘤細(xì)胞生長、壞死及對周圍組織的浸潤情況。

2.8檢測移植瘤微血管密度 免疫組化SABC法步驟如下：移植瘤石蠟片脫蠟、水化后，檸檬酸微波修復(fù)抗原、滅活內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉20 min，滴加CD34單克隆抗體(1∶200稀釋)，4 ℃過夜，滴加生物素標(biāo)記二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，自來水返藍(lán)，脫水透明并封片。各組織計(jì)數(shù)5個視野微血管，取均值。

2.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行多個樣本均數(shù)比較的單因素方差分析和兩兩比較的t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1HDPS-2Ⅱ的理化性質(zhì) 見圖1。由圖1可知，HDPS-2Ⅱ呈現(xiàn)單一對稱峰，表明其為均一性多糖；根據(jù)2.2項(xiàng)下方法作相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y1=-4.478 7x1+5.809 3(r1=0.999 2)，求得HDPS-2Ⅱ的相對分子質(zhì)量為8.2×103Da。

圖1HDPS-2Ⅱ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和相對分子質(zhì)量測定色譜圖

Fig.1 Chromatogram of purity and molecular weight of HDPS-2Ⅱ

蛋白質(zhì)的含量測定：以蛋白溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x2)、吸光度值為縱坐標(biāo)(y2)，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y2=0.021 6x2+0.044，r2=0.991 5。HDPS-2Ⅱ的蛋白含量為2.08%。

糖醛酸的含量測定：以糖醛酸溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x3)、吸光度值為縱坐標(biāo)(y3)，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y3=0.003 3x3+0.000 6，r3=0.999 9。HDPS-2Ⅱ的糖醛酸的含量為12.08%。

硫酸基的含量測定：以硫酸基溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x4)、吸光度值為縱坐標(biāo)(y4)、標(biāo)準(zhǔn)曲線為y4=0.002 4x4+0.010 7，r4=0.998 5。HDPS-2Ⅱ的硫酸基含量為0.24%。

氨基的含量測定：以對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x5)、吸光度值為縱坐標(biāo)(y5)，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y5=0.048 6x5+0.102，r5=0.999 0。HDPS-2Ⅱ的氨基含量為4.89%。

3.2HDPS-2Ⅱ?qū)δ[瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響 采用MTT法檢測HDPS-2Ⅱ?qū)Ω伟┘?xì)胞SMMC-7721、HCCLM3和HepG2生長的影響，發(fā)現(xiàn)HDPS-2Ⅱ?qū)CCLM3和SMMC-7721的生長無明顯抑制作用，在高質(zhì)量濃度時對HepG2增殖有較弱的抑制作用。結(jié)果見圖2。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，HDPS-2Ⅱ可明顯抑制HepG2細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果見圖3。

圖2HDPS-2Ⅱ?qū)δ[瘤細(xì)胞增殖的影響

Fig.2 Effect of HDPS-2Ⅱ on tumor cell proliferation

圖3HDPS-2Ⅱ?qū)epG2細(xì)胞遷移的影響

A.不同濃度HDPS-2Ⅱ?qū)epG2劃痕實(shí)驗(yàn)的影響；B.各組劃痕愈合寬度分析。與對照組比較**P<0.01。

Fig.3 Effect of HDPS-2Ⅱ on HepG2 migration

A.effects of different concentrations of HDPS-2Ⅱ on the wound scratch assay of HepG2 cells；B.analysis of the width of scratch healing in each group.Compared with control group**P<0.01.

3.3蠐螬多糖對H22荷瘤小鼠的腫瘤抑制作用 隨著給藥時間的延長，CTX組小鼠出現(xiàn)食欲減退、皮毛無光澤和反應(yīng)遲鈍的現(xiàn)象，HDPS組和HDPS-2Ⅱ高、中、低劑量組狀態(tài)較好，體質(zhì)量與CTX組相比明顯增加(P<0.05)。除HDPS-2Ⅱ低劑量組外，各組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

3.4蠐螬多糖對荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響 CTX組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均比對照組明顯降低，HDPS組胸腺指數(shù)較CTX組有所增加，HDPS-2Ⅱ組脾臟指數(shù)比CTX組明顯增高，且隨著劑量增加，脾臟指數(shù)有增加趨勢，胸腺指數(shù)有降低趨勢(P<0.05)。見表2。

3.5蠐螬多糖對荷瘤小鼠外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的影響 見表2。由表2可知，CTX組白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞均比對照組明顯降低(P<0.05)。HDPS組和HDPS-2Ⅱ各劑量組白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞比CTX組明顯增高(P<0.05)。

表1蠐螬多糖對小鼠H22移植瘤生長的抑制作用

組別劑量/mg·kg-1體質(zhì)量增加/g瘤質(zhì)量/g抑制率/%對照組4.71±0.850.25±0.04CTX組202.05±0.84?0.10±0.04?60.0HDPS組204.30±1.39#0.13±0.07?48.1HDPS-2Ⅱ低劑量組107.30±1.50?#0.22±0.1112.1HDPS-2Ⅱ中劑量組206.10±2.73?#0.12±0.14?52.0HDPS-2Ⅱ高劑量組505.41±0.81#0.11±0.11?56.9

注：與對照組比較*P< 0.05，與CTX組比較#P<0.05。

表2蠐螬多糖對荷瘤小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的影響

組別劑量/mg·kg-1胸腺指數(shù)/mg·g-1脾臟指數(shù)/mg·g-1白細(xì)胞數(shù)量/1×109·L-1淋巴細(xì)胞數(shù)量/1×109·L-1對照組1.63±0.225.52±0.796.73±1.485.43±1.44CTX組251.09±0.20?4.19±0.65?1.98±0.66?0.94±0.32?HDPS組201.48±0.16#4.81±0.455.10±0.63#3.78±0.50#HDPS-2Ⅱ低劑量組101.55±0.19#5.20±0.66#7.08±1.70#4.38±1.28#HDPS-2Ⅱ中劑量組201.42±0.265.67±1.23#5.80±2.23#4.00±1.77#HDPS-2Ⅱ高劑量組501.36±0.296.68±0.56?#4.30±1.46#2.66±1.09#

注：與對照組比較*P<0.05，與CTX組比較#P<0.05。

3.6組織病理學(xué)和微血管密度觀察 肉眼可見荷瘤小鼠H22移植瘤體呈結(jié)節(jié)狀，剖面呈魚肉狀，且對照組的腫瘤體積明顯大于其他各組。HE染色結(jié)果顯示：對照組腫瘤細(xì)胞核大且細(xì)胞質(zhì)少，細(xì)胞生長旺盛；CTX組出現(xiàn)大面積壞死的瘤組織；多糖給藥組腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異較大，其中HDPS-2Ⅱ中、高劑量組可見明顯的腫瘤壞死，壞死程度隨劑量增加而增大。結(jié)構(gòu)見圖4。CD34免疫組化結(jié)果顯示，蠐螬多糖可抑制腫瘤組織微血管生成，其中HDPS-2Ⅱ中、高劑量組抑制作用較顯著。見圖5。

圖4各組腫瘤組織病理觀察結(jié)果

A.對照組；B.CTX組；C.HDPS組；D.HDPS-2Ⅱ低劑量組；E.HDPS-2Ⅱ中劑量組；F.HDPS-2Ⅱ高劑量組。標(biāo)尺：50 μm。

Fig.4 Histopathological observation results of tumor tissue in each group

A.control group；B.CTX group；C.HDPS group；D.HDPS-2Ⅱ low dose group；E.HDPS-2Ⅱ middle dose group；F.HDPS-2Ⅱ high dose group.Scale bar：50 μm.

圖5微血管密度觀察

A.對照組；B.環(huán)磷酰胺組；C.HDPS組；D.HDPS-2Ⅱ低劑量組；E.HDPS-2Ⅱ中劑量組；F.HDPS-2Ⅱ高劑量組。箭頭：微血管；標(biāo)尺：50 μm。

Fig.5 Microvascular density observation

A.control group；B.cyclophosphamide group；C.HDPS group；D.HDPS-2Ⅱ low-dose group；E.HDPS-2Ⅱ medium-dose group；F.HDPS-2Ⅱ high-dose group. Arrow:microvasculature；Scale bar:50 μm.

4 討論

早在《本草綱目》中就有記載蠐螬系微溫有毒物?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，蠐螬提取物可抑制多種腫瘤生長[20]，并對腫瘤的防治和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能具有重要意義[21]。

本實(shí)驗(yàn)通過MTT實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和建立H22肝癌移植瘤小鼠模型，表明蠐螬均一性多糖組分HDPS-2Ⅱ體外對肝癌細(xì)胞增殖影響較弱，可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的遷移，且體內(nèi)對H22肝癌細(xì)胞有明顯的抑制作用。實(shí)驗(yàn)對小鼠免疫器官指數(shù)、白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行測定的結(jié)果顯示，與CTX組相比，蠐螬多糖可明顯增加荷瘤小鼠脾臟指數(shù)、白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量，隨蠐螬多糖劑量增加，脾臟指數(shù)呈上升趨勢。免疫組化染色顯示，HDPS-2Ⅱ可抑制腫瘤局部微血管的形成。結(jié)果提示，HDPS-2Ⅱ在體內(nèi)并非直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖而發(fā)揮抗腫瘤作用，而有可能通過抑制遷移、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和抑制微血管生成發(fā)揮抗腫瘤作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。目前臨床上腫瘤的有效治療都存在嚴(yán)重的免疫抑制，本實(shí)驗(yàn)中蠐螬多糖在抑制腫瘤的同時具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，這種雙重作用將保護(hù)腫瘤病人機(jī)體及各受累器官，并促進(jìn)臨床綜合治療和康復(fù)過程，提高病人的生存質(zhì)量。此研究中，多糖組分HDPS-2Ⅱ與蠐螬總多糖相比顯示出更強(qiáng)的抗腫瘤活性，說明蠐螬多糖抗腫瘤活性與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，有待進(jìn)一步進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系的研究。結(jié)果顯示，蠐螬多糖HDPS-2Ⅱ在抗腫瘤作用的同時，還有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，因此蠐螬多糖有望作為抗腫瘤的新藥開發(fā)利用。