雙波長(zhǎng)HPLC法測(cè)定防風(fēng)通圣丸中6種成分的含量

李 帆，緱慧君，許雪峰*

(1.四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；2.漢中市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，漢中 723000)

防風(fēng)通圣丸出自金代名醫(yī)劉完素著名的《宣明論方》，由防風(fēng)、薄荷、大黃、桔梗、川芎、白術(shù)、荊芥穗、麻黃、芒硝、滑石、當(dāng)歸和石膏等17味藥組成，具有疏風(fēng)解表、清熱通便之功效，主治風(fēng)熱壅盛、表里俱實(shí)癥[1-2]。其標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)藥典》2015年版一部。但藥典中只收載了防風(fēng)通圣丸中黃芩苷的含量測(cè)定，目前文獻(xiàn)中使用HPLC法同時(shí)測(cè)定防風(fēng)通圣丸4種以上有效成分尚未見報(bào)道[3-4]。本法采用雙波長(zhǎng)HPLC法對(duì)梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、連翹苷、甘草苷和甘草酸銨6種有效成分同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，方法簡(jiǎn)單、可靠，可更好地用于該產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-2010A高效液相色譜儀，C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(日本島津公司)；AS-10200BD超聲波清洗儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；BT25S，BS224S電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；JY10002電子分析天平(上海舜寧恒平科學(xué)儀器有限公司)

1.2試藥 對(duì)照品：連翹苷(批號(hào)1110821-201213，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.3%)，梔子苷(批號(hào)110749-201718，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.6%),芍藥苷(批號(hào)110736-201539，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.4%)，黃芩苷(批號(hào)110715-201720，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.5%)，甘草苷(批號(hào)111610-201106，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.7%)和甘草酸胺(批號(hào)110731-201418，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.1%)，均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。防風(fēng)通圣丸：內(nèi)蒙古天奇中蒙制藥有限公司(批號(hào)12160710)，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠(批號(hào)16080112)，陜西利君現(xiàn)代中藥有限公司(批號(hào)161002)；甲醇，乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher公司)；磷酸(分析純，成都市科龍化工儀器廠)；水為Millipore制水儀所制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 日本島津C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相：乙腈(A)-0.5 mL·L-1磷酸水溶液(B)，梯度洗脫依次為：0～9 min 14%A，8～15 min 19%A，15～35 min 19%～50%A，35～36 min 50%～100%A，36～40 min 100%～14%A。 流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：237 nm(梔子苷、芍藥苷、連翹苷、甘草苷和甘草酸銨)，280 nm(黃芩苷)。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取梔子苷、芍藥苷、連翹苷、黃芩苷、甘草苷和甘草酸銨對(duì)照品10.36，12.63，10.95，10.76，16.97和10.69 mg，分別置于100，50，50，50，50和50 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，放冷至室溫，加甲醇定容，即得含梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、連翹苷、甘草苷和甘草酸銨質(zhì)量濃度分別為103.6，243.51，284.19，208.71，318.02和398.09 μg·mL-1的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、連翹苷、甘草苷和甘草酸銨儲(chǔ)備液2，1，1，1，1和1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得含梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、連翹苷、甘草苷和甘草酸銨質(zhì)量濃度分別為20.72，24.35，28.42，20.87，31.80和39.81 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液 取防風(fēng)通圣丸適量，研細(xì)，精密稱取0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理45 min，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性樣品溶液 按照防風(fēng)通圣丸的制法和配比，制成缺梔子、白芍、連翹、黃芩和甘草的陰性樣品，并按照2.2.2項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.3專屬性實(shí)驗(yàn) 取2.2項(xiàng)下制備好的混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，按照2.1項(xiàng)下方法分別進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖1。沒有與對(duì)照品溶液保留時(shí)間相對(duì)應(yīng)的色譜峰，表明陰性樣品對(duì)所測(cè)的6種成分無(wú)干擾。

圖1HPLC圖

A.對(duì)照品(237 nm)；B.對(duì)照品(280 nm)；C.缺白芍、梔子、甘草、黃芩和連翹陰性樣品(237 nm)；D.缺白芍、梔子、甘草、黃芩和連翹陰性樣品(280 nm)；E.樣品(237 nm)；F.樣品(280 nm)；1.梔子苷；2.芍藥苷；3.甘草苷；4.黃芩苷；5.連翹苷；6.甘草酸銨。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substance (237 nm)；B.reference substance (280 nm)；C.Paeony，Gardenia，Licorice，Scutellaria and Forsythia negative sample (237 nm);D.Paeony，Gardenia，Licorice，Scutellaria and Forsythia negative sample (280 nm)；E.sample (237 nm)；F.sample (280 nm)；1.geniposide；2.paeoniflorin；3.liquiritin；4.baicalin；5.forsythia；6.ammonium glycyrrhizinate.

2.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取防風(fēng)通圣丸，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液(批號(hào)16080112)，室溫放置，在制備后0，2，4，6，8，12，16和24 h按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，計(jì)算得梔子苷、芍藥苷、甘草苷、黃芩苷、連翹苷和甘草酸銨峰面積的RSD值分別為0.70%，0.24%，0.24%，0.90%，0.89%和0.19%。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5線性關(guān)系考察 取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣2，5，10，15和20 μL，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)(y)、對(duì)照品溶液進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得梔子苷、芍藥苷、甘草苷、黃芩苷、連翹苷和甘草酸銨的線性回歸方程分別為：y1=32 145.68x1+3 134.841(r1=0.999 9)，y2=36 934.61x2-7 678.1(r2=0.999 7)，y3=69 791.79x3-1 585.78 (r3=0.999 9)，y4=101 066x4+5 405.024(r4=0.999 9)，y5=28 922.24x5+10 550.18(r5=0.995 8)，y6=23 260.25x6+1 659.84(r6=0.999 9)。結(jié)果表明，梔子苷、芍藥苷、甘草苷、黃芩苷、連翹苷和甘草酸銨分別在0.041～0.414，0.048～0.487，0.062～0.622，0.057～0.568，0.042～0.417和0.080～0.796 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6精密度實(shí)驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)下配制的混合對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得芍藥苷、梔子苷、黃芩苷、連翹苷、甘草苷和甘草酸銨峰面積的RSD值分別為1.17%，0.11%，0.11%，0.43%，0.11%和0.41%，結(jié)果表明，該儀器精密度良好。

2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批(批號(hào)12160710)防風(fēng)通圣丸6份，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，用2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)得梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、連翹苷、甘草苷和甘草酸銨的含量分別為0.689，0.869，10.170，0.829，0.869和3.207 mg·g-1，RSD值分別為1.04%，1.24%，0.27%，1.34%，0.89%和0.79%。

2.8回收率實(shí)驗(yàn) 取同一批防風(fēng)通圣丸(批號(hào)12160710)，精密稱定質(zhì)量為0.25 g的供試品6份，分別精密加入梔子苷、芍藥苷、甘草苷、黃芩苷、連翹苷和甘草酸銨對(duì)照品溶液，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，用0.22 μm的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為10 μL，記錄色譜圖并計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1加樣回收率測(cè)定結(jié)果

Tab.1 Determination results of recovery tests (n=5)

成分稱樣量/g樣品含量/mg加入量/mg實(shí)測(cè)量/mg回收率/%平均回收率/%梔子苷0.250 10.237 80.207 20.459 7107.199.60.249 40.250 10.207 20.457 7100.20.250 00.242 20.207 20.445 898.30.260 60.246 30.207 20.435 091.10.250 50.240 60.207 20.449 2100.7芍藥苷0.250 10.201 20.194 80.396 4100.298.20.249 40.209 80.194 80.401 798.50.250 00.203 50.194 80.396 599.10.260 60.200 50.194 80.390 697.60.250 50.203 90.194 80.386 795.4甘草苷0.250 10.600 90.636 01.214 696.599.70.249 40.614 40.636 01.272 8104.70.250 00.606 90.636 01.257 5102.30.260 60.609 70.636 01.241 999.40.250 50.609 00.636 01.218 295.8黃芩苷0.250 13.198 42.375 05.583 1100.4100.00.249 43.251 02.375 05.714 3104.80.250 03.394 12.375 05.733 598.50.260 63.420 02.375 05.731 297.30.250 53.407 22.375 05.753 598.9連翹苷0.250 10.243 00.208 70.452 6104.6101.30.249 40.251 20.208 70.458 499.40.250 00.251 00.208 70.474 9107.30.260 60.252 00.208 70.456 998.20.250 50.248 30.208 70.451 197.2甘草酸銨0.250 10.994 20.796 11.840 8106.3107.90.249 41.018 50.796 11.868 4106.70.250 00.997 80.796 11.877 0110.00.260 61.003 40.796 11.898 6108.50.250 51.040 80.796 11.909 5107.9

2.9樣品的含量測(cè)定 取批號(hào)分別為161002，12160710和16080112的防風(fēng)通圣丸，按照2.2.2項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，并按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為10 μL，分別計(jì)算樣品中梔子苷、芍藥苷、甘草苷、黃芩苷、連翹苷和甘草酸銨的含量。結(jié)果見表2。

表2防風(fēng)通圣丸各組分含量測(cè)定結(jié)果

Tab.2 Determination results of Fangfengtongsheng Pills

批號(hào)梔子苷/mg·g-1芍藥苷/mg·g-1黃芩苷/mg·g-1連翹苷/mg·g-1甘草苷/mg·g-1甘草酸銨/mg·g-11610021.0680.5259.4350.3410.5702.059121607100.6590.81910.1670.2450.8663.297160801120.6560.5378.7580.1511.1713.063

3 討論

3.1流動(dòng)相的選擇 以《中國(guó)藥典》2015年版一部為參考，比較了乙腈-水和甲醇-水2種不同的流動(dòng)相體系，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與甲醇相比，乙腈的洗脫能力更強(qiáng)，系統(tǒng)分離效果更好。因此在本實(shí)驗(yàn)中使用乙腈-水體系要優(yōu)于甲醇-水體系。同時(shí)在水中加入磷酸改性劑后，各組分的峰形和分離度均有明顯提高[5]，優(yōu)化色譜條件為乙腈-0.5 mL·L-1磷酸水溶液。

3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 《中國(guó)藥典》2015年版一部中防風(fēng)通圣丸黃芩苷的含量測(cè)定波長(zhǎng)選擇為280 nm[1-2]，故本方法選擇280 nm為黃芩苷的測(cè)定波長(zhǎng)[6-14]，而梔子苷、連翹苷、芍藥苷、甘草苷和甘草酸銨的最大吸收波長(zhǎng)分別為238，277，230，237和237 nm[15-19]，經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，最終選擇237 nm為桅子苷、芍藥苷、連翹苷、甘草苷和甘草酸銨的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3供試品溶液制備方法的選擇 由于芍藥苷的熱穩(wěn)定性不好，故不考慮回流提取。在實(shí)驗(yàn)中，分別比較了體積分?jǐn)?shù)為50%，70%和100%的甲醇溶液和體積分?jǐn)?shù)為50%，70%和100%的乙醇溶液作為溶劑進(jìn)行30，45和60 min的超聲提取[20-23]，最終結(jié)果以體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇超聲45 min的提取效果較好。因此選擇該方法為供試品溶液的提取方法。

3.4溫度的選擇 分別比較了柱溫為25和30 ℃條件下防風(fēng)通圣丸供試品中各組分的分離度，發(fā)現(xiàn)柱溫在25 ℃時(shí)甘草苷和連翹苷分離度較好，故選擇柱溫為25 ℃。