頂空毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定美司鈉原料和注射液的殘留溶劑

張秉華，王小亮，郭歡迎，馬 麗

(1.陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，西安 710065；2.咸陽市中心醫(yī)院藥學(xué)部，咸陽712000)

美司鈉(mesna，化學(xué)名2-巰基乙磺酸鈉)，別名美斯納和巰乙磺酸鈉。美司鈉的原研企業(yè)為美國Baxter Hithcare公司，商品名為Mesnex，目前已在多個(gè)國家上市，我國目前批準(zhǔn)的美司鈉制劑僅有美司鈉注射液1種劑型，該劑型有2個(gè)規(guī)格，分別為4 mL∶0.4 g和2 mL∶0.2 g。國內(nèi)最先仿制的企業(yè)為江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。美司鈉可防止用高劑量異環(huán)磷酰胺或環(huán)磷酰胺進(jìn)行腫瘤化療時(shí)引起的出血性膀胱炎等泌尿系統(tǒng)上皮毒性[1]。與抗腫瘤化療藥異環(huán)磷酰胺或環(huán)磷酰胺合用，作為泌尿系統(tǒng)保護(hù)劑[2]，是一種可去除丙烯酸等的毒性或防止它形成但又不干擾母體藥物治療效果的新型抗毒劑[1-4]。

在藥品質(zhì)量研究中，殘留溶劑的控制是一個(gè)關(guān)鍵的安全性質(zhì)控項(xiàng)目。根據(jù)國內(nèi)美司鈉原料的生產(chǎn)工藝，其在生產(chǎn)過程中用了多種有機(jī)溶劑，但國內(nèi)僅有國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBH03952007[5]項(xiàng)下對(duì)殘留溶劑乙醇進(jìn)行了控制，其他現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[5-10]中均未對(duì)殘留溶劑進(jìn)行控制。美司鈉注射劑作為可靜脈推注的注射劑，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)控制安全性。殘留有機(jī)溶劑均是對(duì)人體有害的，故對(duì)美司鈉原料和注射液進(jìn)行殘留有機(jī)溶劑檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以水為溶劑的殘留溶劑氣相色譜測(cè)定方法簡便快速、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可很好地測(cè)定美司鈉原料及美司鈉注射液中的殘留溶劑。

1 儀器與試藥

1.1儀器 GC-2010Plus氣相色譜儀，AOC-5000Plus自動(dòng)進(jìn)樣器，Lab Solutions島津色譜工作站,FID檢測(cè)器(日本島津公司)；全自動(dòng)空氣源HA-300型(北京中惠普分析技術(shù)研究所)；AE-240電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2試藥 美司鈉原料由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供，批號(hào)分別為20150101，20150206和20150210。美司鈉注射液來自國內(nèi)3個(gè)生產(chǎn)廠家，其中江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司8批，批號(hào)分別為MS150402，MS150401，MS150603，MS150602，MS150601，MS140403，MS140602和MS150403；齊魯制藥(海南)有限公司5批，批號(hào)分別為B1H1507002，B1H1406002，B2H1505004，B2H1501001和B2H1503003；山西普德藥業(yè)股份有限公司3批，批號(hào)分別為3140901，7140501和3150701；甲醇(批號(hào)E7SJ31，體積分?jǐn)?shù)99.9%)，色譜純，購自韓國德山DUKSAN；乙醇(批號(hào)20150824，體積分?jǐn)?shù)99.7%)，丙酮(批號(hào)20150824，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%)，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；異丙醇(色譜純)，批號(hào)SHBF3579V，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%，購自SIGMA公司；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件的選擇與優(yōu)化

2.1.1確定樣品中涉及的殘留溶劑種類 美司鈉原料的生產(chǎn)工藝國內(nèi)采用二溴乙烷與亞硫酸鈉反應(yīng)生成2-溴乙基磺酸鈉，再與硫脲反應(yīng)生成2-S-Z磺酸硫脲鹽，將2-S-Z磺酸硫脲鹽與氨水反應(yīng)生成巰乙磺酸胍氨化產(chǎn)物，再通過與Cationresin和氫氧化鈉反應(yīng)得到美司鈉[11]。結(jié)合美司鈉原料合成、純化過程，參考《中國藥典》2015年版四部附錄殘留溶劑測(cè)定法的指導(dǎo)原則[12]及有關(guān)文獻(xiàn)[13-18]，由于理論上美司鈉注射劑為水針，制劑過程不應(yīng)再引入其他殘留溶劑，注射劑中的殘留溶劑均應(yīng)來自原料藥或輔料中引入的極微量殘留，因此擬對(duì)美司鈉合成中用到的甲醇、異丙醇、丙酮以及純化工藝中用到的乙醇4種有機(jī)溶劑建立相應(yīng)的頂空氣相色譜法進(jìn)行測(cè)定。

2.1.2氣相色譜檢測(cè)法的建立

2.1.2.1色譜柱的選擇 通過比較不同填料及材質(zhì)的填充柱(玻璃柱和不銹鋼柱)以及不同極性的石英毛細(xì)管色譜柱，待測(cè)組分在高分子多孔小球不銹鋼(或玻璃)填充柱中各組分分離效果不夠理想，同時(shí)峰形較寬、柱效低。若選擇極性毛細(xì)管柱或中等極性毛細(xì)管柱則分離情況不如HP-1的非極性石英毛細(xì)管柱。故最終選擇HP-1(30 m×0.25 mm，0.25 μm)石英毛細(xì)管柱。

2.1.2.2溶劑的選擇 由美司鈉的溶解性可知，其在水中易溶。待測(cè)的甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮均能與水互溶，且水本身在FID檢測(cè)器中沒有信號(hào)響應(yīng)，可很好地提高方法的檢測(cè)限，因此選擇水做溶劑本身對(duì)本實(shí)驗(yàn)無干擾。

2.1.2.3頂空條件的選擇 由于溶劑選擇水，且4個(gè)待測(cè)有機(jī)溶劑揮發(fā)性均較好，頂空條件選擇藥典推薦條件，頂空瓶溫度為75 ℃，平衡時(shí)間為30 min。

2.1.2.4優(yōu)化色譜條件 在60 ℃等溫條件下各待測(cè)組分無法做到基線分離，且出峰過快，選用30 ℃柱溫，分離好，出峰時(shí)間合適，但考慮到實(shí)驗(yàn)條件較為苛刻，最終選擇柱溫為40 ℃。同時(shí)考慮樣品中可能的殘留，選擇待測(cè)組分分離后對(duì)色譜柱進(jìn)行程序升溫。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)最終選擇的色譜條件為：進(jìn)樣口溫度為200 ℃；檢測(cè)器為FID，檢測(cè)器溫度為250 ℃；載氣為氮?dú)猓簧V柱為HP-1石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，柱溫為程序升溫，初始溫度為40 ℃；保持5 min，再以20 ℃·min-1的升溫速率升至150 ℃。經(jīng)優(yōu)化過的色譜條件，各組分分離良好。色譜圖見圖1。

2.2線性關(guān)系考察 混合對(duì)照品溶液的配制：分別精密稱取甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮4種有機(jī)溶劑13.21，9.85，11.54和15.95 mg，置于同一100 mL量瓶中，用純化水溶解并稀釋至刻度，作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別吸取上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1，1，2，3和5 mL，分別置于20，10，10，10和10 mL量瓶中，用純化水稀釋并定容至刻度，搖勻，分別作為標(biāo)準(zhǔn)曲線1～5號(hào)溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液含甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮線性范圍分別為6.6～66.0，4.9～49.1，5.8～58.0和8.0～80.0 μg·mL-1。按照氣相色譜法進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品溶液峰面積為縱坐標(biāo)(y)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，建立線性回歸方程。結(jié)果見表1。

表1回歸方程與線性范圍

Tab.1 Linear ranges and regression equations of calibration curves

組分回歸方程r線性范圍/μg·mL-1甲醇y1=172.80x1+378.380.999 46.6^66.0乙醇y2=371.58x2+479.340.999 94.9^49.1異丙醇y3=706.80x3-339.880.999 55.8^58.0丙酮y4=1 135.67x4+592.830.999 68.0^80.0

圖1GC圖

A.空白溶液；B.對(duì)照溶液；C.江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司樣品；D.齊魯制藥(海南)有限公司樣品；E.山西普德藥業(yè)股份有限公司樣品；1.甲醇；2.乙醇；3.丙酮；4.異丙醇。

Fig.1 GC chromatograms

A.blank solution；B.standard solution；C.sample of Jiangsu Hengrui Medicine Limited Company；D.sample of Qilu Pharmaceutical (Hainan) Limited Company；E.sample of Shanxi Pude Pharmaceutical Limited Company；1.methanol；2.ethanol；3.acetone；4.isopropanol.

2.3檢測(cè)限與定量限 取2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密量取不同體積并逐步稀釋，按照2.1.2.4項(xiàng)下色譜方法進(jìn)樣并測(cè)定，當(dāng)所測(cè)殘留溶劑的信噪比達(dá)到要求時(shí)，甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮的檢測(cè)限(S/n=3)分別為1.32，0.98，1.16和1.60 μg·mL-1；定量限(S/n=10)分別為3.96，2.94，3.48和4.80 μg·mL-1。

2.4精密度實(shí)驗(yàn) 取標(biāo)準(zhǔn)曲線3號(hào)溶液，按照2.1.2.4項(xiàng)下氣相色譜條件測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣5次，通過5次測(cè)定的峰面積進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果表明，所測(cè)5次甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮峰面積的RSD值分別為1.8%，1.6%，1.9%和1.0%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取已知?dú)埩羧軇┖康拿浪锯c原料作為供試品，精密稱定0.2 g，6份，分別置于15 mL頂空瓶中，精密加入標(biāo)準(zhǔn)曲線3號(hào)溶液2.0 mL，密封制備成重復(fù)性實(shí)驗(yàn)樣品溶液，3 d連續(xù)按照2.1.2.4項(xiàng)下氣相色譜方法重復(fù)測(cè)定樣品中各有機(jī)溶劑的含量，測(cè)定結(jié)果分別為：甲醇加樣回收率分別為98.3%，96.9%和97.7%；乙醇加樣回收率分別為97.9%，100.2%和99.5%；異丙醇加樣回收率分別為100.6%，99.0%和99.8%；丙酮加樣回收率分別為99.8%，100.3%和100.5%。日間重復(fù)性的3組分回收數(shù)據(jù)表明，該色譜方法重復(fù)性良好。

2.6回收率實(shí)驗(yàn) 取已知?dú)埩羧軇┖康拿浪锯c原料作為供試品，精密稱定0.2 g,9份，分別置于15 mL頂空瓶中，分為3組，第1，2和3組分別加入標(biāo)準(zhǔn)曲線2，3和4號(hào)溶液2.0 mL，各質(zhì)量濃度加3份(共9份)，密封制得相當(dāng)于檢測(cè)限度3個(gè)水平(50%，100%，和150%)的溶液。依照2.1.2.4項(xiàng)下氣相色譜方法測(cè)定并計(jì)算回收率。3個(gè)水平的甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮的回收率測(cè)定結(jié)果：低水平分別為98.6%，96.8%，99.7%和99.1%；中水平分別為96.7%，99.9%，100.3%和98.3%；高水平分別為96.5%，98.0%，98.8%和100.0%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該色譜方法回收率良好。

2.7美司鈉原料及注射劑殘留溶劑的測(cè)定 分別取美司鈉原料0.2 g，精密稱定，置于15 mL頂空瓶中，加水2.0 mL，密封，作為原料供試品溶液；取美司鈉注射液2.0 mL，密封，作為注射劑供試品溶液。按照2.1.2.4項(xiàng)下氣相色譜條件進(jìn)行測(cè)定，各企業(yè)美司鈉注射液中殘留溶劑的種類不一致，差異較大。

江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供的3批原料及8批注射劑殘留溶劑均為乙醇，在該企業(yè)提供的原料藥生產(chǎn)工藝中，原料結(jié)晶用了乙醇，殘留的乙醇可能為美司鈉原料中的乙醇?xì)埩?。注射劑中乙醇的殘留最大質(zhì)量濃度為24.305 μg·mL-1。

齊魯制藥(海南)有限公司5批注射劑中殘留溶劑均為甲醇，在該企業(yè)提供的原料藥標(biāo)準(zhǔn)中，控制了乙醇的含量，此次檢測(cè)中乙醇質(zhì)量濃度均小于5 μg·mL-1，樣品中甲醇?xì)埩糇畲筚|(zhì)量濃度為19.769 μg·mL-1。

山西普德藥業(yè)股份有限公司的3批注射劑殘留溶劑測(cè)定結(jié)果差異較大，一批中甲醇、乙醇及異丙醇3種溶劑均有檢出；一批中檢出了甲醇及乙醇；另一批中僅檢出乙醇。樣品中甲醇、乙醇和異丙醇?xì)埩糇畲筚|(zhì)量濃度分別為12.52，36.67和5.545 μg·mL-1。

3 討論

美司鈉原料及其注射劑標(biāo)準(zhǔn)收載情況：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的查詢情況，《美國藥典》40NF35、《英國藥典》2017年版和《歐洲藥典》9.0版中均收載了美司鈉原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但均未收載注射劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。其中《歐洲藥典》9.0版和《英國藥典》2017年版內(nèi)容完全一樣。《日本藥局方》中該品種原料和注射劑均未收載。

國內(nèi)美司鈉原料現(xiàn)行版標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBH03952007[5]和WS-024(X-017)-95[6]。美司鈉注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)WS-250-(X-018)-95(1)(2)收載于《國家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)》第35冊(cè)[7]；同時(shí)現(xiàn)行版標(biāo)準(zhǔn)還有批給企業(yè)的國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBH01942009[8]和YBH24302006[9]以及進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)JX20100098[10]。

無論原料標(biāo)準(zhǔn)或注射液標(biāo)準(zhǔn)，國內(nèi)所執(zhí)行的現(xiàn)行版標(biāo)準(zhǔn)中，僅國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBH03952007[5]項(xiàng)下對(duì)乙醇的殘留量進(jìn)行了控制，其他現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中均未對(duì)殘留溶劑進(jìn)行控制。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無論原料或注射劑，其殘留溶劑都能夠被檢測(cè)到，且甲醇屬于2類殘留溶劑，說明原料藥項(xiàng)下殘留溶劑的檢測(cè)存在一定缺陷。

本方法快速、準(zhǔn)確，樣品制備簡便，對(duì)美司鈉原料和注射劑中的殘留溶劑能夠有效控制，可有效避免殘留溶劑的漏檢情況。