藿香正氣丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

陳雪琴，周仔莉，賈文江，王艷萍

(商洛市藥品檢驗所，商洛 726000)

藿香正氣丸(水丸及濃縮丸)是由廣藿香、紫蘇葉、白芷、白術(shù)(炒)、陳皮、半夏(制)、厚樸(姜制)、茯苓、桔梗、甘草、大腹皮、大棗和生姜制成[1]，具有解表化濕、理氣和中的功效[2-8]，用于外感風(fēng)寒、頭痛昏重等癥，臨床一般用于治療感冒、蕁麻疹、酸中毒和氣滯胃痛等病癥[9-14]。此方制劑簡單、療效明確，已被應(yīng)用多年，但現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅限于簡單的顯微觀察及一些常規(guī)檢查項，為更好地控制其質(zhì)量，參考對加味藿香正氣丸的研究[15-19]及藿香正氣水、藿香正氣滴丸等的標(biāo)準(zhǔn)[20-26]，本文分別對藿香正氣丸水丸和濃縮丸主要成分進行TLC鑒別和含量分析研究，以期為其提供更全面的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters e2695型高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；賽多利斯SQP型電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；AS1512560型超聲波清洗機(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；四號藥篩(湖南省常德粒度分析儀器廠)。

1.2試藥 橙皮苷對照品(批號110721-201617，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.1%)，和厚樸酚對照品(批號110730-201614，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.3%)以及厚樸酚對照品(批號110729-200411)均購自中國食品藥品檢定研究院；藿香正氣丸(水丸)(批號160501，陜西香菊藥業(yè)集團有限公司)，(批號：007509，007607，陜西漢王藥業(yè)有限公司)；藿香正氣丸(濃縮丸)(批號160504，南京同仁堂藥業(yè)有限責(zé)任公司)，(批號20160201，黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司)，(批號20150807，馬鞍山天?？邓帢I(yè)有限公司)，(批號14C30，蘭州佛慈制藥股份有限公司)；乙腈、甲醇均為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1廣藿香和厚樸的TLC鑒別 取本品濃縮丸2.5 g(水丸6 g)，研細，加乙醚20 mL，超聲處理(150 W，45 Hz)15 min，過濾，揮干濾液，殘渣加乙酸乙酯1 mL溶解，作為供試品溶液。另取和厚樸酚、厚樸酚及百秋李醇對照品適量，分別加乙酸乙酯制成3種質(zhì)量濃度均為1 mg·mL-1的對照品溶液。分別吸取上述供試品溶液10 μL，3種對照品各5 μL，點于同一硅膠G板上。展開劑為乙酸乙酯-石油醚(60～90 ℃)-甲酸(15∶85∶2)，展開，取出，晾干，噴以50 mL·L-1的香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果表明，供試品色譜與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的斑點。見圖1A。

圖1TLC圖

A.廣藿香、厚樸：1.厚樸酚對照品；2.和厚樸酚對照品；3.百秋李醇對照品；N1～N4.濃縮丸供試品；S1～S3.水丸供試品。B.陳皮：S1～S3.水丸供試品；N1～N4.濃縮丸供試品；1.陳皮對照藥材；2.橙皮苷對照品。C.甘草：1.甘草酸銨對照品；S1～S3.水丸供試品；N1～N4.濃縮丸供試品。D.白術(shù)：N1～N4.濃縮丸供試品；S1～S3.水丸供試品；1.白術(shù)對照藥材。E.白芷：S1～S3.水丸供試品；1.白芷對照藥材；2.歐前胡素；3.異歐前胡素；N1～N4.濃縮丸供試品。

Fig.1 TLC chromatograms

A.HerbaPogostemonisandMagnoliaofficinalisCortex:1.magnolol reference substance；2.honokiol reference substance；3.autumn lee alcohol reference substance；N1-N4.concentrated pills sample；S1-S3.water pills sample.B.PericarpiumCitriReticulatae:S1-S3.water pills sample；N1-N4.concentrated pills sample；1.PericarpiumCitriReticulatae contrast medicinal materials；2.aurantiamarin reference substance.C.GlycyrrhizaeRadixetRhizoma:1.monoammonium glycyrrhizinate reference substance；S1-S3.water pills sample；N1-N4.concentrated pills sample.D.RhizomaAtractylodisMacrocephalae:N1-N4.concentrated pills sample；S1-S3.water pills sample；1.RhizomaAtractylodisMacrocephalae contrast medicinal materials.E.AngelicaeDahuricaeRadix:S1-S3.water pills sample；1.AngelicaeDahuricaeRadix contrast medicinal materials；2.imperatorin reference substance； 3.isoimperatorin reference substance；N1-N4.concentrated pills sample.

2.2陳皮的TLC鑒別 取本品濃縮丸2.5 g(水丸6 g)，研細，加水20 mL，超聲處理(150 W，45 Hz)5 min使溶解，加20 mL環(huán)己烷振搖提取，分取水層(環(huán)己烷液備用)，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液(水層備用)，揮干溶劑，加甲醇2 mL使殘渣溶解，作為供試品溶液。稱取0.5 g陳皮對照藥材，加20 mL甲醇，超聲處理(150 W，45 Hz)30 min，過濾，揮干溶劑，加甲醇1 mL使殘渣溶解，作為對照藥材溶液。取橙皮苷對照品，制成甲醇飽和溶液，作為對照品溶液。吸取上述供試品溶液5 μL，對照品溶液和對照藥材溶液各2 μL，點于同一硅膠G(用40 mL·L-1醋酸鈉溶液制備)薄層板上。展開劑為甲醇-乙酸乙酯-水(17∶100∶10)，展開，取出，晾干，噴50 mL·L-1的三氯化鋁乙醇溶液，置于紫外光燈365 nm處檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中在與陳皮對照藥材色譜和橙皮苷對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的熒光斑點。見圖1B。

2.3甘草的TLC鑒別 取2.2項下的水層，加正丁醇振搖提取3次，每次10 mL，合并正丁醇液，用水洗滌2次，每次10 mL，棄水層，回收正丁醇液的溶劑至干，加甲醇2 mL使殘渣溶解，作為供試品溶液。取適量甘草酸銨對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。分別吸取上述2種溶液各3 μL，點于同一硅膠GF254板上，展開劑為正丁醇-甲醇-氨溶液(8→10)(10∶3∶4)，展開，取出，晾干，置于紫外光燈254 nm處檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與甘草酸銨對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的斑點。見圖1C。

2.4白術(shù)的TLC鑒別 取本品濃縮丸2.5 g(水丸6 g)，研細，加20 mL正己烷，超聲處理(150 W，45 Hz)15 min，過濾后揮干溶劑，殘渣加正己烷1 mL使溶解，作為供試品溶液。稱取1 g白術(shù)對照藥材，同法制成對照藥材溶液。分別吸取供試品溶液和對照藥材溶液各5 μL，點于同一硅膠G板上。展開劑為乙酸乙酯-石油醚(1∶5)(60～90 ℃)，展開，取出，晾干，置于紫外光燈365 nm處檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中在與白術(shù)對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的熒光斑點。見圖1D。

2.5白芷的TLC鑒別 取2.2項下的環(huán)己烷液，低溫回收溶劑至干，加1 mL乙酸乙酯溶解殘渣，作為供試品溶液。取白芷對照藥材0.5 g，加乙醚10 mL，浸漬振搖1 h，過濾后揮干濾液，加乙酸乙酯1 mL使殘渣溶解，作為對照藥材溶液。取異歐前胡素和歐前胡素對照品各適量，分別加乙酸乙酯制成質(zhì)量濃度均為1 mg·mL-1的2種對照品溶液。吸取供試品溶液和白芷對照藥材溶液各5 μL，對照品溶液各3 μL，點于同一硅膠G板上。展開劑為乙醚-石油醚(2∶3)(60～90 ℃)，展開，取出，晾干，置于紫外光燈365 nm處檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與白芷對照藥材及異歐前胡素和歐前胡素對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的熒光斑點。見圖1E。

2.6HPLC測定

2.6.1色譜條件的確定與系統(tǒng)適用性實驗 填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動相A為乙腈，流動相B為水，梯度洗脫，洗脫程序為：0～30 min為25%→75%A，30～40 min為75%→80%A，40～60 min為80%→25%A；流速為1.0 mL·min-1；波長為283 nm；柱溫為25 ℃。按照橙皮苷、厚樸酚與和厚樸酚峰計算理論塔板數(shù)應(yīng)不低于3 000，供試品溶液的制備見2.6.3項下方法，取供試品各20 μL，分別注入液相色譜儀，橙皮苷、厚樸酚與和厚樸酚理論塔板數(shù)均大于3 000，分離度大于1.5，符合要求。

2.6.2混合對照品溶液的制備 精密稱取對照品橙皮苷、和厚樸酚以及厚樸酚11.80，5.0和8.40 mg，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液。制成含橙皮苷、和厚樸酚以及厚樸酚對照品質(zhì)量濃度分別為0.453，0.199和0.336 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.6.3供試品溶液的制備 精密稱取研細的藿香正氣丸(水丸)和藿香正氣丸(濃縮丸)2.17和0.83 g，分別置于250 mL具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇溶液25 mL，混勻，稱定質(zhì)量，超聲30 min，放冷，補足減失的質(zhì)量，過濾，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。見圖2。

2.6.4線性范圍考察 取2.6.2項下制備的混合對照品溶液，分別進樣2，5，10，15和20 μL，測定峰面積，以對照品的進樣量(μg)為橫坐標(biāo)(x)、峰面積值為縱坐標(biāo)(y)進行線性回歸方程，回歸方程為：橙皮苷y1=78 439x1+29 815，r1=0.999 0，和厚樸酚y2=21 084x2+16 510，r2=1.000 0，厚樸酚y3=52 791x3-15 754，r3=0.999 5，結(jié)果表明，橙皮苷、和厚樸酚及厚樸酚分別在0.95～9.46，0.32～3.16和0.89～8.90 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.6.5精密度考察 精密量取2.6.2項下制備的混合對照品溶液20 μL，連續(xù)進樣6次，測定其峰面積，橙皮苷、和厚樸酚及厚樸酚峰面積的RSD值分別為0.51%，0.28%和0.54%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.6.6重復(fù)性實驗 取同一批藿香正氣丸粉末6份，按照2.6.3項下方法制備供試品溶液，進樣20 μL，測定峰面積，分別計算含量，橙皮苷、和厚樸酚及厚樸酚含量的RSD值分別為1.59%，1.74%和1.62%，結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性較好。

圖2HPLC圖

A.混合對照品溶液；B.濃縮丸供試品溶液；C.水丸供試品溶液；1.橙皮苷；2.和厚樸酚；3.厚樸酚。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.mixed reference solution；B.concentrated pills sample solution；C.water pills sample solution；1.aurantiamarin；2.magnolol；3.honokiol.

2.6.7穩(wěn)定性實驗 取2.6.3項下制備的供試品溶液20 μL，分別在0，2，4，8，12，18和24 h進行測定，測定其峰面積，結(jié)果橙皮苷、和厚樸酚以及厚樸酚3種成分的RSD值分別為1.52%，1.26%和1.71%，RSD值均小于2.0%，該數(shù)據(jù)符合實驗規(guī)定。

2.6.8加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的過四號篩的同批次濃縮丸樣品粉末0.83 g，水丸2.17 g，各平行做6份，分別加入4.008 1和1.887 9 mg的橙皮苷對照品，1.926 4和1.232 9 mg的和厚樸酚對照品以及3.857 0和2.517 2 mg的厚樸酚對照品，按照2.6.3項下方法制備供試品溶液，進樣20 μL，測峰面積，計算回收率及RSD值，數(shù)據(jù)結(jié)果見表1和表2。水丸平均加樣回收率分別為100.63%,101.41%和100.17%，RSD值分別為0.94%,1.23%和0.45%；濃縮丸平均加樣回收率分別為100.87%，101.30%和100.40%，RSD值分別為1.28%，1.14%和1.22%，實驗結(jié)果表明，供試品溶液的制備準(zhǔn)確性高、數(shù)據(jù)可靠。

表1水丸橙皮苷、和厚樸酚以及厚樸酚加樣回收率實驗結(jié)果

Tab.1 Results of recovery test of aurantiamarin，magnolol and honokiol in water pills

成分稱樣量/g樣品中實際含量/mg加入量/mg測定量/mg回收率/%平均加樣回收率/%RSD/%橙皮苷2.169 24.086 34.008 18.165 9101.78100.630.942.170 74.089 14.008 18.102 4100.132.170 94.089 54.008 18.153 9101.402.170 34.088 44.008 18.121 4100.622.170 94.089 54.008 18.062 799.132.169 94.087 74.008 18.125 1100.73和厚樸酚2.169 21.955 11.926 43.939 0102.98101.411.232.170 71.956 51.926 43.905 5101.172.170 91.956 71.926 43.874 999.572.170 31.956 11.926 43.892 3100.502.170 91.956 71.926 43.920 9101.962.169 91.955 81.926 43.925 8102.26厚樸酚2.169 23.868 53.857 07.738 1100.33100.170.452.170 73.871 23.857 07.738 0100.252.170 93.871 63.857 07.714 099.622.170 33.870 53.857 07.747 4100.522.170 93.871 63.857 07.755 7100.702.169 93.869 93.857 07.712 699.63

表2濃縮丸橙皮苷、和厚樸酚以及厚樸酚加樣回收率實驗結(jié)果

Tab.2 Results of recovery test of aurantiamarin，magnolol and honokiol in concentrated pills

成分稱樣量/g樣品中實際含量/mg加入量/mg測定量/mg回收率/%平均加樣回收率/%RSD/%橙皮苷0.830 51.885 61.887 93.782 2100.46100.871.280.829 91.884 81.887 93.753 298.970.829 61.884 11.887 93.811 2102.080.829 41.885 41.887 93.821 8102.570.830 81.885 61.887 93.785 3100.630.830 41.885 11.887 93.782 5100.51和厚樸酚0.830 51.247 01.232 92.479 9100.00101.301.140.829 91.246 11.232 92.479 9100.070.829 61.245 71.232 92.498 8101.640.829 41.245 41.232 92.490 7101.000.830 81.247 51.232 92.513 8102.710.830 41.246 91.232 92.509 5102.41厚樸酚0.830 52.510 12.517 25.044 6100.69100.401.220.829 92.508 22.517 24.989 598.570.829 62.507 32.517 25.071 7101.870.829 42.506 72.517 25.009 299.410.830 82.511 02.517 25.063 2101.390.830 42.509 82.517 25.038 9100.48

3 討論

3.1白術(shù)提取試劑的選擇 本研究中參考已有文獻，選取乙醚和正己烷2種試劑，用同樣的方法處理樣品，發(fā)現(xiàn)對于濃縮丸，2種試劑均可作出理想的TLC圖；用乙醚提取的水丸，亦能得到目的斑點，但干擾斑點太多。綜合2種丸劑，正己烷更適用。

3.2色譜條件的選擇 本文采用乙腈和水梯度洗脫的方法同時測定橙皮苷、和厚樸酚以及厚樸酚的含量，參照采用《中國藥典》2015年版藿香正氣滴丸、藿香正氣水以及藿香正氣軟膠囊測定橙皮苷、厚樸酚以及和厚樸酚的條件：甲醇-水比例在10%～90%之間等度洗脫測定、甲醇-乙腈-水(40∶20∶40)等度洗脫、乙腈-5 mL·L-1冰醋酸為流動相梯度洗脫、甲醇-水為流動相進行梯度洗脫、乙腈-2 mL·L-1磷酸為流動相進行梯度洗脫等方法，最終經(jīng)過多次多種方法比較，甲醇-水溶劑系統(tǒng)雖出峰時間快，但橙皮苷分離度和理論塔板數(shù)不夠、乙腈-5 mL·L-1冰醋酸溶劑系統(tǒng)峰形較差，乙腈-2 mL·L-1磷酸溶劑系統(tǒng)峰分離度不好，峰形較差，最終得到在乙腈-水溶劑系統(tǒng)中橙皮苷及其他2個成分峰的分離度、理論塔板數(shù)和拖尾因子均符合要求。經(jīng)過全波段掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)橙皮苷在283 nm波長處有最大吸收，和厚樸酚以及厚樸酚2個成分在293 nm波長處有最大吸收，但三者在283 nm處均能同時出現(xiàn)且都有較強的吸收，方法簡便、快捷。

3.3方法選擇 本方法借鑒了《中國藥典》2015年版藿香正氣丸的含量測定方法，對比了橙皮苷、厚樸酚以及和厚樸酚在乙腈、甲醇和水等不同溶劑中的溶解情況，對照品與供試品在甲醇溶劑中的溶解性良好，其液相色譜中色譜峰的保留時間能夠保持一致，分離度較高；在15，30，45和60 min的超聲時間中，30 min用時最少且效果最好，且超聲的方法較萃取、回流等其他方法樣品的制備過程簡單、高效，最為合理；提取方法中不同比例的甲醇體積分?jǐn)?shù)進行比較之后，濃縮丸和水丸同時在體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇中的溶解性最好，最適宜3個成分的含量測定，且加標(biāo)回收率較高，說明藿香正氣丸3個樣品峰在該實驗條件下能夠被準(zhǔn)確定性定量測定，且基線噪聲較小，干擾峰較少，準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和重復(fù)性都很好，可作為藿香正氣丸的質(zhì)量控制方法。