威靈仙中的三萜皂苷類成分及其抗關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制的研究進(jìn)展

鄭佳逸,辛貴忠，劉麗芳

(中國藥科大學(xué)，天然藥物活性組分與藥效國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009)

威靈仙為毛茛科鐵線蓮屬植物威靈仙ClematischinensisOsbeck)、棉團(tuán)鐵線蓮(ClematishexapetalaPall.)或東北鐵線蓮(ClematismanshuricaRupr.)的干燥根和根莖[1]，具有祛風(fēng)除濕、止痛通絡(luò)等功效。其單方和復(fù)方制劑在臨床上都有廣泛的應(yīng)用，主要可用于風(fēng)濕痹痛、肢體麻木，筋脈攣急、屈伸不利等癥狀，具有抗菌消炎、止痛解痙、抗腫瘤、降血壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化及心肌梗死等藥理活性[2-4]。威靈仙所含化學(xué)成分比較復(fù)雜，主要包括三萜皂苷類[5-6]、黃酮及多元酚類[7-8]、內(nèi)酯和生物堿類[9-10]，此外還有一些多糖類成分[11-12]、揮發(fā)性成分[13-14]、以及原白頭翁素[15]和白頭翁素[16]等。其中，三萜皂苷已被證實(shí)是威靈仙藥材的主要活性成分，亦是威靈仙藥材質(zhì)量控制的關(guān)鍵指標(biāo)。因此，本文將介紹我國藥典收載的不同來源威靈仙藥材中三萜皂苷類成分的分布情況，同時(shí)對其治療關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制進(jìn)行概述，為科學(xué)利用威靈仙藥材、開展威靈仙藥材的成分分析、并對三種威靈仙藥材進(jìn)行基原和真?zhèn)舞b別提供依據(jù)。

1 皂苷類化學(xué)成分的研究

國內(nèi)眾多學(xué)者對《中國藥典》收載的三種不同來源威靈仙中的三萜皂苷類成分進(jìn)行了一系列分離純化研究，從威靈仙中分離得到40余種三萜皂苷類成分，從東北鐵線蓮中分離得到17種三萜皂苷類成分，但是關(guān)于棉團(tuán)鐵線蓮中三萜皂苷類成分的報(bào)道較少，僅找到了7種并且這7種都是與其他兩種所共有的成分(表1)。此外，從威靈仙和東北鐵線蓮中分離得到的三萜皂苷類成分在種類及含量上均有所不同[2, 17]，表明三種基原威靈仙藥材中的三萜皂苷類成分存在著一定的差異。

從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，根據(jù)苷元類型大致可將威靈仙中的三萜皂苷分為四類，包括齊繳果酸型(oleanolic：Ole)、常春藤皂苷元(hederagenin：Hed)、表常春藤皂苷元(epihederagenin：Epi)和絲石竹苷元(gypsogenin：Gyp)。大部分的威靈仙三萜皂苷苷元為Ole和Hed型，少數(shù)為Epi和Gyp型[3, 18]。這四類皂苷元的基本骨架都為齊墩果烷型，只是在C-23和/或C-24位取代的基團(tuán)有所差別。Hed型、Epi型和Gpy型皂苷元的取代方式分別為C-23處連有—OH，C—24處連有—OH和C—23處連有—C=O。而Ole型皂苷元的C-23和C-24僅連有—CH3(圖1)。

威靈仙三萜皂苷類成分側(cè)鏈糖的取代種類多樣，其中大部分在C-3和C-28位均有糖鏈取代，少數(shù)只在C-3或C-28位取代單糖鏈。此外，有一些皂苷還有異阿魏?；?Isoferuloyl, IF)，對甲氧基桂皮?；?P-methoxy cinnamyl, MC)和3,4-二甲氧基桂皮?；?3,4-dimethoxy cinnamyl, DMC)取代在C-28位的糖鏈上，且這幾種基團(tuán)常連接在位于糖鏈近末端的葡萄糖基團(tuán)上[24-25]。糖鏈中結(jié)合的糖主要包括有鼠李糖(Rha)、核糖(Rib)、葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)和木糖(Xyl)[3,24-25](圖2，表1)。

圖1 威靈仙三萜皂苷四種苷元結(jié)構(gòu)式

表1 三種威靈仙所含三萜皂苷類成分

續(xù)表1

續(xù)表1

注：A：具有單個(gè)糖鏈的皂苷；B：具有兩個(gè)糖鏈但不包含特殊取代基的皂苷；C：具有特殊取代基的雙糖鏈皂苷。W：威靈仙ClematischinensisOsbeck.；D：東北鐵線蓮ClematismanshuricaRupr.；M：棉團(tuán)鐵線蓮ClematishexapetalaPall.

圖2 威靈仙三萜皂苷糖鏈(A)和取代基(B)結(jié)構(gòu)

2 威靈仙皂苷類成分治療關(guān)節(jié)炎的機(jī)制研究

2.1 抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的作用機(jī)制研究

盡管威靈仙治療關(guān)節(jié)炎已有數(shù)千年的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)，但其作用機(jī)制尚不明確，三萜皂苷類成分作為其發(fā)揮藥效的活性物質(zhì)，國內(nèi)外眾多學(xué)者對其抗關(guān)節(jié)炎的藥理作用機(jī)制進(jìn)行了一系列的探索研究。

2.1.1 抑制細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活

大量研究表明RA疾病的發(fā)生發(fā)展與多種細(xì)胞因子的表達(dá)密切相關(guān)，如一系列白細(xì)胞介素(IL-3、IL-6、IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和一些干擾素(IFN-γ)等[33-35]。而與JAK激酶家族受體相關(guān)的酪氨酸激酶已被證實(shí)參與RA的過程，一旦被激活，JAKs便會(huì)募集并激活STATs，當(dāng)STAT被激活后會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄[36]。在RA中，STAT的激活與滑膜炎癥，滑膜成纖維細(xì)胞(FLSs)的存活都密切相關(guān)[37]。鄧龍飛[38]等發(fā)現(xiàn)灌胃給予威靈仙總皂苷可有效緩解佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)的足趾腫脹和體重的減輕，并且可以有效改變滑膜組織炎細(xì)胞浸潤和組織增生。并且分別從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測了滑膜細(xì)胞中JAK2、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子STAT3的mRNA水平、磷酸化JAK2(p-JAK2)和磷酸化STAT3(p-STAT3)的蛋白表達(dá)水平，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示威靈仙總皂苷可能通過抑制JAK2/STAT3信號通路的激活來達(dá)到抗炎作用。在細(xì)胞內(nèi)眾多的信號通路中，磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)對于細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的誘導(dǎo)和放大發(fā)揮著重要作用[39]。Akt作為PI3K的下游，一旦被激活可以發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用[40]。已有研究表明PI3K/AKT信號通路的激活會(huì)促進(jìn)滑膜增生和TNF-α的分泌[41-42]?；诖?，Wang等[43]研究了從威靈仙提取的三萜皂苷AR-6對膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠體內(nèi)PI3K/AKT信號通路的干預(yù)作用。病理切片顯示AR-6有效的緩解關(guān)節(jié)炎滑膜增生和炎性細(xì)胞浸潤。根據(jù)滑膜組織免疫組化的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于模型組AR-6可以減少TNF-α的產(chǎn)生，并且抑制PI3K和磷酸化Akt的表達(dá)。以上研究結(jié)果表明AR-6發(fā)揮抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎活性的機(jī)制與PI3K/Akt信號通路相關(guān)。相似的，NF-κB作為RA中研究最多的轉(zhuǎn)錄通路，主要調(diào)節(jié)促炎因子的水平和抗凋亡相關(guān)通路[43]，因此也被廣泛的應(yīng)用于治療RA的藥物機(jī)制[44-46]。研究發(fā)現(xiàn)與CIA模型組大鼠相比，AR-6給藥組大鼠的血清中TNF-α、IL-1β水平均有所下降，同時(shí)NF-κB p65的表達(dá)明顯受到抑制。而AR-6處理的大鼠滑膜組織中TNF-α、COX-2和p65的表達(dá)都有所降低。提示AR-6對于CIA大鼠具有潛在的抗炎作用，并且這種作用機(jī)制可能與NF-κB信號通路受到抑制相關(guān)[47]。

2.1.2 抑制氧化應(yīng)激

細(xì)胞因子的大量產(chǎn)生可以通過上調(diào)ROS的釋放進(jìn)而引發(fā)氧化應(yīng)激，反過來又可以再調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá), 因此細(xì)胞內(nèi)異常的氧化還原狀態(tài)將會(huì)誘發(fā)促炎因子的產(chǎn)生[48-49]。有研究報(bào)道在TNF-α刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，從東北鐵線蓮中提取出的靈仙新苷(C-AR)可以降低TNF-α誘導(dǎo)的 VCAM-1和ICAM-1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)了C-AR還可以抑制p65的轉(zhuǎn)位和IκBα的磷酸化水平。此外，C-AR對TNF-α刺激的細(xì)胞內(nèi)降低的O2和H2O2水平都有回調(diào), 并可以降低NOX4和NADPH氧化酶的活性。但值得一提的是，C-AR并沒有表現(xiàn)出直接的清除活性氧的能力。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明AR可以通過調(diào)節(jié)依賴于NF-κB信號通路的NADPH氧化酶的活性來降低VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)[50]。

2.1.3 免疫抑制作用

RA疾病發(fā)生過程中的另一特點(diǎn)是機(jī)體免疫紊亂，因此免疫療法也在逐漸進(jìn)入大眾視線并有望得到較好的臨床效果[51]。在關(guān)節(jié)炎自身免疫的發(fā)生發(fā)展過程中Treg和Th17亞基呈現(xiàn)一種相反的免疫調(diào)節(jié)作用，故調(diào)節(jié)Treg和Th17亞基的平衡對于治療關(guān)節(jié)炎是非常重要的[52-53]。目前已有研究證明C-AR在小腸部位有較好的膜透過性，可以通過被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入腸粘膜[54]?；诖耍琗iong[55]等人推測C-AR治療RA的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腸粘膜免疫系統(tǒng)相關(guān)。利用AA大鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，C-AR的免疫抑制作用主要是通過上調(diào) PPS 淋巴細(xì)胞中CD4(+)CD25(+)Foxp3(+)Treg細(xì)胞的百分比，并誘導(dǎo)ConA-來激活PPs淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抑炎的細(xì)胞因子(IL-10)，同時(shí)下調(diào)IL-17A和TNF-α的水平；此外，C-AR還具有抑制Th17細(xì)胞表型的活性，從而調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞和Th17的比例失衡，最終達(dá)到調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)炎中的免疫反應(yīng)的作用。

2.1.4 抑制纖維化

除了炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和氧化應(yīng)激，有研究提出滑膜組織纖維化也是RA發(fā)病過程中一個(gè)重要事件，而纖維原細(xì)胞的激活和細(xì)胞外基質(zhì)重塑是纖維化發(fā)生的主要誘因[56-57]。Li[58]等人最近詳細(xì)探討了C-AR抑制RA滑膜組織纖維化的作用機(jī)制，揭示了關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)和纖維化之間的關(guān)系。研究結(jié)果表明，缺氧條件下琥珀酸堆積會(huì)上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的激活，最終加劇CIA大鼠滑膜組織的炎癥反應(yīng)和纖維化。而C-AR可以通過減輕滑膜缺氧降低琥珀酸的堆積，從而抑制NLRP3炎癥小體的激活來達(dá)到抑制炎癥和纖維化的作用。

2.1.5 抑制NO的產(chǎn)生

NO是RA發(fā)生發(fā)展過程中的另一個(gè)促炎因子[59-60]。目前已有研究在RA患者體內(nèi)檢測到過高的NO濃度，并證實(shí)了其與RA炎癥反應(yīng)的聯(lián)系[60-61]。Sun等[62]分別利用AA大鼠、腹腔巨噬細(xì)胞和TNF-α刺激的滑膜細(xì)胞考察了AR-6的體內(nèi)體外抗炎活性及機(jī)制。結(jié)果證明AR-6可以抑制體內(nèi)體外IL-1β和IL-6這些促炎因子的分泌。值得一提的是，AR-6對AA大鼠血清中iNOS水平有抑制作用，并且在腹腔巨噬細(xì)胞和TNF-α刺激的滑膜細(xì)胞中AR-6可以減少 NO的產(chǎn)生。

2.2 抗骨關(guān)節(jié)炎(OA)作用機(jī)制研究

OA是一種慢性的關(guān)節(jié)退行性疾病，以關(guān)節(jié)軟骨侵蝕為特點(diǎn)[63]。盡管目前OA的發(fā)病機(jī)理和病因尚不明確，但是可以確定的是炎癥因子引起的軟骨損傷是其發(fā)病的關(guān)鍵原因之一[64-65]。因此，威靈仙三萜皂苷治療OA的作用機(jī)制研究主要圍繞軟骨保護(hù)展開。①抑制軟骨破壞相關(guān)酶的表達(dá)：Hsieh等[66]提取了人原代軟骨細(xì)胞，利用LPS刺激后，發(fā)現(xiàn)威靈仙中的丙酮部位的皂苷提取物(CC6)通過抑制COX-2的表達(dá)可以發(fā)揮前列腺素E2(PGE2)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)抑制作用，提示CC6可以通過抑制軟骨破壞相關(guān)酶的表達(dá)來發(fā)揮軟骨保護(hù)作用。②抗凋亡和線粒體損傷：Wu等[67]利用硝普鈉刺激兔原代軟骨細(xì)胞釋放NO，并用不同濃度的威靈仙總皂苷提取物處理24h后，檢測了細(xì)胞的核形態(tài)、細(xì)胞凋亡率、線粒體功能和caspase-3的活性。結(jié)果顯示，威靈仙皂苷提取物可以防止硝普鈉誘發(fā)的軟骨細(xì)胞凋亡。此外，硝普鈉導(dǎo)致的細(xì)胞線粒體膜勢能的去極化和caspase-3的激活都能被威靈仙皂苷提取物阻斷。基于以上結(jié)果可以推測，威靈仙皂苷保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的機(jī)制可能與抑制線粒體損傷和激活caspase-3發(fā)揮的抗凋亡作用相關(guān)。③防止細(xì)胞外基質(zhì)降解：Wu等[68]在另外一項(xiàng)研究中通過給關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射谷氨酸鈉碘乙酸(MIA)建立大鼠骨OA模型，發(fā)現(xiàn)威靈仙總皂苷提取物可以抑制MIA引起的軟骨損傷和蛋白聚糖(PG)降解，而陽性藥雙氯芬酸僅呈現(xiàn)出微弱的緩解作用。這說明威靈仙皂苷提取物可以通過防止細(xì)胞外基質(zhì)降解和軟骨細(xì)胞損傷起到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用。

3 威靈仙皂苷類成分體內(nèi)代謝研究

威靈仙作為傳統(tǒng)中藥，通常以口服用藥為主，進(jìn)入機(jī)體后易受到胃腸道的影響，如酸堿度、腸道菌群及各種酶類的影響。威靈仙主要活性成分為總皂苷，當(dāng)其在機(jī)體內(nèi)發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化后，生物利用度會(huì)明顯降低。總皂苷進(jìn)入生物系統(tǒng)后，在腸道一系列酶的作用下(包括β葡糖苷酶和酯酶)[69-70]，發(fā)生I相代謝反應(yīng)水解脫去葡萄糖、鼠李糖等糖基，形成不同種類的總皂苷代謝產(chǎn)物，故其代謝產(chǎn)物也可能是藥效成分[71]。此前已有文獻(xiàn)表明人參皂苷Rb1的代謝產(chǎn)物Compound K比起原型有更強(qiáng)的生物活性[72-73]。研究威靈仙總皂苷在生物體內(nèi)的藥物代謝變化，揭示原型成分與代謝成分之間的代謝關(guān)系、轉(zhuǎn)化規(guī)律，對威靈仙的藥效及作用機(jī)制研究將起到重要意義。

4 結(jié) 語

本文首先對藥典收載的三種基原威靈仙中的三萜皂苷類成分的分布進(jìn)行了綜述，一共總結(jié)出56中三萜皂苷類成分，其中有45種存在于威靈仙中，17種存在于東北鐵線蓮中，還有7種存在于棉團(tuán)鐵線蓮中。其中，屬于威靈仙特有的三萜皂苷有32種，屬于東北鐵線蓮特有的三萜皂苷有11種。此外，并沒有找到棉團(tuán)鐵線蓮種特有的三萜皂苷。因此，對這三種基原威靈仙的三萜皂苷類成分進(jìn)行更系統(tǒng)的化學(xué)成分分離和結(jié)構(gòu)鑒定依然是非常有必要的。

三萜皂苷作為威靈仙發(fā)揮抗關(guān)節(jié)炎活性的主要成分，其具體的作用機(jī)制尚不明確，傳統(tǒng)的研究機(jī)制主要集中于軟骨保護(hù)和抑制細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)導(dǎo)，近幾年研究發(fā)現(xiàn)的抑制氧化應(yīng)激、抑制纖維化和免疫調(diào)節(jié)等作用機(jī)制為其臨床應(yīng)用提供了新的依據(jù)。此外，針對威靈仙皂苷的體內(nèi)代謝行為研究發(fā)現(xiàn)其生物利用度極低，進(jìn)而限制了其新藥開發(fā)的進(jìn)程。因此，針對其體內(nèi)代謝產(chǎn)物的研究或進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾對更好的發(fā)揮其藥效具有很大的意義。