星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取脫皮馬勃粗多糖工藝

史偉國，白國棟，宗希明，袁 寰，杜 鵑，高慶東

(1.佳木斯大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007;2.佳木斯市中醫(yī)醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

脫皮馬勃(LasiosphaerafenzliiReich.)，為灰包科脫皮馬勃屬真菌的干燥子實體。被收載于《中國藥典》(2015版第一部)。其性味辛平，歸肺經(jīng)。外用治鼻衄，創(chuàng)傷出血[1]。馬勃所含的重要活性成分多糖，因其具有保護肝臟損傷[2]、清除超氧離子自由基[3]等作用，在近幾年越來越被重視。這種真菌類多糖的獲取途徑有很多種，可以通過對真菌干燥的子實體的水提取獲得[4]，也可以通過菌絲體和發(fā)酵液的代謝產(chǎn)物獲得[5]，還可以在酶的輔助下提取獲得[6]。本項研究是在一定功率的超聲波輔助下，水料比、提取時間和提取溫度對馬勃粗多糖提取率的影響，應(yīng)用星點設(shè)計-響應(yīng)面試驗設(shè)計法，優(yōu)化超聲波輔助提取馬勃的條件，以期能為馬勃多糖的提取和進一步研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬勃藥材購于黑龍江省佳木斯市百草堂藥店，經(jīng)佳木斯市中醫(yī)醫(yī)院制劑室主任中藥師丁麗鑒定為脫皮馬勃(LasiosphaerafenzliiReich.)，粉碎過篩，作為樣品。葡萄糖、濃硫酸、苯酚、乙醇均為國產(chǎn)分析純試劑，水為蒸餾水。

1.2 儀器

KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV-2550型紫外可見分光光度計(島津公司)，AUW220D型電子分析天平(島津公司)，SF-200B型高速粉碎機(上海中藥機械廠)，HH-24型恒溫水浴鍋(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)，202系列電熱恒溫干燥箱(上海葉拓儀器儀表有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取馬勃粗多糖

稱取經(jīng)粉碎后過3號篩馬勃粉末5.0 g，用87%乙醇50 mL浸泡過夜，抽濾，濾渣用87%乙醇洗脫2次。室溫放置，待乙醇自然揮發(fā)后殘渣在超聲功率為200 W的條件下，按一定液料比、提取溫度、提取時間進行提取。抽濾，離心。用苯酚-硫酸法[7]，測定吸光度，計算馬勃粗多糖的提取率。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取干燥至恒重葡萄糖粉末10 mg，定容至100 mL，待葡萄糖完全溶解,得0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL分別置于試管中，分別加水2、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8 mL，加5%苯酚溶液1.0 mL，振勻，快速加入濃硫酸5.0 mL，放置10 min，振勻，置100 ℃水浴15 min后，取出室溫放涼，測定吸光度，在490 nm波長處出現(xiàn)最高值，以葡萄糖的濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A490)為縱坐標(biāo)繪制曲線。

1.3.3 馬勃粗多糖的測定

精密吸取按“1.3.1”項下方法提取后，稀釋至合適濃度的樣品溶液2 mL，按照苯酚-硫酸法測定馬勃粗多糖吸光度。根據(jù)樣品吸光度計算多糖提取率。

1.3.4 單因素試驗設(shè)計

在超聲功率固定為200 W的條件下，以提取溫度40 ℃，提取時間40 min，液料比為15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 mL·g-1，分別提取粗多糖，測提取率；以提取溫度40 ℃，液料比為25∶1 g·mL-1，提取時間為30、40、50、60、70 min，分別提取粗多糖，測提取率；以提取時間為50 min，液料比為25∶1 g·mL-1時，提取溫度30、40、50、60、70 ℃，分別提取多糖，測定多糖提取率。確定最佳提取條件。

1.3.5 星點設(shè)計-響應(yīng)面試驗設(shè)計

以液料比(X1)、提取時間(X2)和提取溫度(X3)3個因素分別選取5個水平對馬勃粗多糖提取率(Y)進行考察，設(shè)計星點試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按“1.3.2”項下操作，得回歸方程A490=50.96C+0.015 3R2=0.999 1

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 提取率計算公式

馬勃粗多糖提取率(%)=

[(A490-0.0153)/50.96×稀釋倍數(shù)×樣品溶液體積]/樣品質(zhì)量

式中：A490為馬勃樣品的吸光度。

2.3 單因素試驗結(jié)果與分析

2.3.1 液料比對提取率的影響

由圖2可知，馬勃粗多糖的提取率在最開始的時候是隨料液比的增加而大幅度增大，差異性顯著，但到達25∶1后繼續(xù)增大料液比，多糖的提取率還會增高，但增高的幅度變小，差異性不顯著，故選料液比25∶1為最佳液料比。

2.3.2 提取時間對提取率的影響

由圖3可知，馬勃粗多糖的提取率在最開始是逐漸上升，后小幅度下降，分析原因可能是在超聲波的空化和機械剪切力的作用下使細(xì)胞迅速破裂，促進胞內(nèi)粗多糖的滲出。但超聲提取時間過長，也會裂解多糖的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致先升后降的結(jié)果。在50 min時，多糖提取率達到最高，故選50 min為最佳提取時間。

2.3.3 提取溫度對提取率的影響

由圖4可知，馬勃粗多糖的提取率是隨著溫度的升高而顯著增大，后小幅度下降，分析原因可能是粗多糖在溶劑中的溶解度隨著溫度的升高而增大，后當(dāng)達到一定溫度后，由于高溫可能對多糖的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致先升后降的結(jié)果。在提取溫度為50 ℃時多糖的提取率最高，故選50 ℃為最佳提取溫度。

圖2 液料比對粗多糖提取率的影響

圖3 提取時間對粗多糖提取率的影響

圖4 提取溫度對粗多糖提取率的影響

2.4 星點設(shè)計-響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)Central Composite Design設(shè)計原理，通過對單因素試驗結(jié)果的分析，星點設(shè)計因素水平見表1。

表1 馬勃粗多糖提取工藝星點設(shè)計因素表

2.5 星點設(shè)計-響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

響應(yīng)值(Y)代表多糖提取率，分別對各因素(X1、X2、X3)進行二項式方程擬合，見表2。

2項式方程擬合模型：Y=3.49+0.42X1+0.21X2+0.16X3-0.12X1X2+0.086X1X3+0.073

X2X3-0.10X2 1-0.28X2 2-0.24X2 3(R2=0.9803)。

由回歸分析結(jié)果(表3)可知，二項式方程擬合模型P<0.000 1，達到高度顯著水平，模型可以通過檢驗，R2=0.980 3，失擬為P>0.05(不顯著)，說明該方程的預(yù)測值比較接近實際值，具有較高的可信度。該實驗的顯著影響因素為：X1、X2、X3、X1X2、X1X3、X2 1、X2 2、X2 3。將不顯著因素刪除，方程簡化為：

Y=3.49+0.42X1+0.21X2+0.16X3-0.12X1X2+0.086X1X3-0.10X2 1-0.28X2 2-0.24X2 3

(R2=0.972 8)

表3 馬勃粗多糖提取工藝回歸分析結(jié)果

2.6 工藝參數(shù)的預(yù)測與優(yōu)化

使用Design-Expert 8.0.6軟件，對已得二項式擬合方程繪制3D響應(yīng)面，見圖5～7。

圖5 液料比與時間對多糖得率的影響3D圖

圖6 液料比與溫度對多糖得率的影響3D圖

圖7 時間與溫度對多糖得率的影響3D圖

根據(jù)二項式模型的預(yù)測，馬勃粗多糖最佳提取工藝為：液料比30∶1( mL∶g),提取時間53.77 min，提取溫度58.33 ℃，多糖提取率為3.88%。根據(jù)上述工藝，采用液料比30 mL·g-1、提取時間54 min、提取溫度58 ℃，平行驗證3次，粗多糖的平均提取率為4.01%，驗證的結(jié)果與模型預(yù)測值相近，因此，該方法可以考慮作為超聲波輔助提取馬勃粗多糖的優(yōu)化與預(yù)測。

3 小 結(jié)

本試驗運用3因素5水平星點設(shè)計-響應(yīng)面法研究了馬勃粗多糖的提取率在固定超聲功率的情況下，和液料比、提取時間、提取溫度這三個因素之間的關(guān)系，并且預(yù)測出最佳提取工藝參數(shù)：液料比30∶1( mL∶g),提取時間53.77 min，提取溫度58.33 ℃。根據(jù)試驗所得最佳工藝進行驗證后，實測平均提取率為4.01%。說明使用該方法來確定馬勃粗多糖的最佳提取工藝預(yù)測性較好，可以為馬勃的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。