谷物及飼料中青霉酸的污染和防控

李曉雪 董燕婕 苑學霞 丁照華 李大鵬 趙善倉

(山東省農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所；山東省食品質量與安全檢測技術重點實驗室1，濟南 250100)(山東農業(yè)大學食品科學與工程學院2，泰安 271018)(山東省農業(yè)科學院玉米研究所3，濟南 250100)

青霉酸(Penicillic Acid, PA)是由不同株系的青霉菌(Penicillium)和曲霉菌(Aspergillus)產生的次生代謝產物，具有致突變和致癌作用，能誘導中國倉鼠卵巢細胞DNA單鏈的斷裂和抑制體外培養(yǎng)小鼠成纖維細胞DNA合成[1-3]；袁慧等[4]1998年調查湖南省霉變飼料發(fā)現(xiàn)有60份霉變飼料中檢出青霉酸，檢出率高達55.0%。1913年Alsberg等[5]在分析糙皮病與霉變玉米之間的關系時，首次從侵染軟毛青霉(P.puberulum)的玉米中分離出青霉酸，并證明了青霉酸對雞、鵪鶉等實驗動物均具有毒性。青霉酸具有誘變性和致癌性，隨膳食攝入對公眾健康產生風險。

1 青霉酸的主要特征

青霉酸是一種無色針狀結晶化合物。熔點83 ℃，沸點在常壓下為285.7 ℃，密度在25 ℃下為1.157 g/mL，易溶于熱水、乙醇、乙醚、苯、氯仿，略溶于冷水(2 g/100 mL)，微溶于熱石油醚，幾乎不溶于戊烷和己烷。青霉酸分子式為C8H10O4，分子量170.16。青霉酸以兩種異構體的形式存在，一種為取代的γ-酮酸(γ-酮-β甲氧基-δ甲叉-A-乙酸)(γ-keto-β-methoxy-δ-methylene-A-hexanoicaci-d)，另一種為γ-羥基內酯(y-hydroxylactonc)，其分子結構如圖1所示。

a γ-酮酸 b γ-羥基內酯圖1 青霉酸的結構式

2 青霉酸的發(fā)生流行

青霉酸是儲藏真菌產生的生物毒素，在5～32 ℃都產毒，在15～20 ℃時產毒最高，在低溫高濕的條件下，該毒素產量增高。其中青霉屬產青霉酸的菌種最多，尤以圓弧青霉菌有毒代謝產物中含量較高。青霉酸存在于谷物中，主要污染玉米、高粱、大麥、小麥、燕麥等糧食作物。1974年Thorpe等監(jiān)測美國玉米，其青霉酸含量為5～230 mg/kg[6]。干燥的辣椒樣品保存在相對濕度為91%～97%的環(huán)境中檢出青霉酸[7]。小麥中青霉酸含量為5～230 mg/kg[8]。

有研究表明，在霉變飼料中青霉菌的污染率占89.30%，而圓弧青霉菌占青霉菌污染率的60.30%[4]，飼料中因青霉酸中毒引起的疾病案例有很多，尤其是位于長江以南的省份較多，之前認為主要是黃曲霉毒素B1(AFB1)引起的中毒，經研究發(fā)現(xiàn)，除AFB1引起的中毒外，青霉酸也有毒性作用，故而青霉酸對飼料安全影響很大[9]。

3 青霉酸的生物合成

圓弧青霉中青霉素酸的生物合成途徑大約有6步構成[10](圖2)。1個單位的乙酰輔酶A同3個單位的丙二酸單酰輔酶A經縮合反應，失去3個分子的二氧化碳生成苔色酸。苔色酸經環(huán)裂解和脫羧作用而生成青霉酸[11]。其反應的最后一步是3-甲基苯醌通過氧化環(huán)裂變生成青霉酸，通過14C同位素示蹤標記，研究結果表明反應需要氧氣、還原型輔酶Ⅱ(NADPH)、黃素單核苷酸(FMN)和Fe2+，其反應方程式為2NADPH++2H++O2+3-甲基苯醌=2NADP+H2O+PA，其反應機制為拜耳-維立格氧化重排[12]。Axberg等[13]應用14C標記的前體物研究圓弧青霉青霉酸的生物合成順序依次是苔色酸生成2-氧-苔色酸、1,4-二氫-6-羥基-2-甲苯、6-羥基-2-甲基-苯醌，最后生成青霉酸。

圖2 青霉酸的生物合成途徑

Sekiguchi等[10]通過N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍處理圓弧靑霉(P.cyclopium)得到了青霉酸陰性突變體(P.cyclopiumNRRL 1888)。培養(yǎng)的圓弧青霉突變體(SK2N6)中快速積累6-甲基-1,2,3-三羥基苯，14C放射性標記的乙酸迅速進入6-甲基-1,2,3-三羥基苯中，同時，含有14C的6-甲基-1,2,3-三羥基苯快速進入圓弧青霉NRRL 1888。研究結果表明，6-甲基-1,2,3-三羥基苯為圓弧青霉合成青霉酸中間產物。青霉酸的生物合成是由一組聚酮合酶(PKSs)酶催化。通過基因敲除技術和逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)研究表明，只有在曲霉菌westerdijkiae中的pks-nrps基因aolc35-6中編碼某些未知的中間體的aomsas基因和參與生物合成的苔色酸和青霉酸的基因[14]。

4 青霉酸的毒性

4.1 細胞毒性

青霉酸能促使人呼吸道上皮細胞死亡，阻斷細胞的能量傳導，降低細胞的呼吸作用[15]。青霉酸通過增加細胞的長度和寬度而導致扁平的和絲狀的細胞的產生，并且這個過程相較于蠟樣芽孢桿菌來說，對傷寒沙門菌影響更大。在青霉酸影響下，傷寒沙門菌的細胞壁和細胞膜明顯的受到破壞，并且一部分細胞質可能隨著細胞的破裂而流出[16]。青霉酸對人卵巢癌細胞系A2780的IC50值為1.5 μg/mL，青霉酸誘導PC-12細胞神經狀突起結構變化，產生神經偶極型突起，同雙丁酰環(huán)腺苷酸誘導作用相似。當青霉酸處理質量濃度為3～6 μg/mL時，誘導許多神經突起從細胞體延伸[17]。小鼠經皮下注射青霉酸，LD50為100 mg/kg，大鼠皮下注射青霉酸1.0 mg，每周2次，64～67周后，注射局部引發(fā)纖維瘤，結果表明有致突變作用[9]。家兔青霉酸急性中毒時，臨床上出現(xiàn)體溫降低，心率先快后慢，呼吸增數(shù)，胃腸蠕動加強，脫毛，蛋白尿和引起孕兔流產等現(xiàn)象，病理學變化主要是腎、肝和心肌細胞變性[18]。

4.2 器官毒性

青霉酸易于與含有巰基的半胱氨酸、谷胱甘肽、精氨酸、組氨酸和賴氨酸發(fā)生反應，通過對青霉酸與半胱氨酸、谷胱甘肽生成的加合物進行鑒定，加合物雞胚表現(xiàn)出毒性[19]。尼西雞經人工染毒60 d內，檢測其病理變化及臟器中的殘留量，結果表明，青霉酸主要侵害肝、腎及心肌細胞，且在臟器中含量分布依次為肝>腎>心，由此表明青霉酸的分布與各臟器的病變程度具有相關性[20]。對雌性狗腹腔注射青霉酸染毒后，會出現(xiàn)腹部漿膜面出血、充血、肝臟竇狀隙擴張現(xiàn)象，肝臟外周小葉肝細胞質中肝糖原量也明顯下降，乳酸脫氫酶數(shù)量也在降低[21]。另外，青霉酸能抑制Na+、Ca2+、K+進入青蛙的離體心肌，引起心臟功能障礙[22]。

4.3 聯(lián)合毒性

青霉酸與飼料中其他毒素如赭曲霉毒素A相互作用，聯(lián)合毒性增強。青霉酸與赭曲霉毒素A聯(lián)合作用于雛雞時，其肝臟與腎臟會出現(xiàn)上皮細胞腫脹和顆粒樣變性，其毛細血管內皮的單核細胞會出現(xiàn)增殖現(xiàn)象，也能觀察到免疫器官退行性變化和淋巴細胞的減少[23]。青霉酸能抑制淋巴細胞的體外增殖，赭曲霉毒素A和青霉酸聯(lián)合作用于豬，可以引起其實驗性腎病[24-25]。赭曲霉毒素A(OTA)與青霉素表現(xiàn)出的協(xié)同作用(P<02<20.05)，而棒曲霉素(PAT)與青霉素表現(xiàn)出拮抗作用(P<02<20.05)[26]。在保加利亞和南非的農場飼料中，多種真菌毒素污染(特別是伏馬毒素B1和青霉酸)引發(fā)了豬霉菌毒素中毒、禽腎病，因此動物和人類長期暴露于多種真菌毒素污染的環(huán)境中，可能是其慢性腎臟疾病產生的一個重要因素[27-28]。

5 青霉酸的作用機制

青霉酸對細菌的生物作用機制是破壞細胞壁和細胞膜結構，增加其通透性[16]。青霉酸通過改變牛巨噬細胞(BoMac)基因表觀遺傳調控中所涉及的關鍵酶而抑制蛋白質和RNA的合成。青霉酸能顯著誘導組蛋白去甲基化酶(JMJD-3)的表達，略微降低組蛋白去乙酰化酶(HDAC)的表達[29]。青霉酸對脲酶的毒性是通過結合酶分子的基本基團硫醇而形成的[30]。青霉酸可通過抑制亮氨酸的進入而阻礙蛋白質的合成，其阻礙作用隨濃度的增高和時間的延長而增強[31]。青霉酸能抑制DNA、RNA、蛋白質和一些含巰基的酶的合成，選擇性抑制細胞膜上的(Na+, K+)-ATP酶活性[32]。Bentley等[11]1962年研究表明青霉酸濃度(80 μmol/L)通過選擇性地抑制各種致病因子和其他群體感應調節(jié)基因影響銅綠假單胞菌的群體感應通信。在Burkitt淋巴瘤Raji細胞中，青霉酸濃度為100～200 μmol/L時通過調節(jié)半胱氨酸蛋白酶8(caspase-8)靶位活性而抑制Fas介導的細胞凋亡[33]。青霉酸作為群體感應抑制劑能顯著提高活細胞比例和中心感染數(shù)，但對相應的噬菌體裂解量影響較小[34]。

6 青霉酸檢測方法

6.1 免疫學方法

6.1.1 酶聯(lián)免疫法

通過青霉酸與牛血清白蛋白、卵清白蛋白結合制備青霉酸完全抗原，通過人工抗原免疫小鼠獲得特異性單克隆抗體[35-36]。在此基礎上采用酶聯(lián)免疫吸附法來測定樣品中青霉酸含量。酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)具有特異性強、靈敏度高、安全性高、操作簡便等特點，但由于樣品中存在的復雜成分會干擾抗原-抗體反應的專一性，因而與色譜學方法相比，ELISA法對基質的要求更高，一般不能同時檢測多種毒素。

6.1.2 免疫金標記法

免疫膠體金技術是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術；朱麗等[37]探討了膠體金標記抗圓弧青霉菌毒素—青霉酸單克隆抗體探針的制備方法，摸索其最佳反應條件并對其活性進行檢測。結果表明，膠體金標記抗青霉酸單克隆抗體的最佳pH為8.2，1 mL膠體金標記的最小蛋白質量為25 μg。金標體與二抗發(fā)生牢固結合，即金標探針具有活性。

6.2 理化分析方法

6.2.1 薄層層析法

Golinski等[38]建立了谷物(大麥、玉米、燕麥、黑麥和小麥樣品)中青霉酸的薄層色譜檢測方法。采用甲苯-乙酸乙酯-90%甲酸作為薄層色譜的展開劑，將展開的色譜板進一步暴露于吡啶、乙酸酐或它們的混合物蒸汽中，通過這種處理將青霉酸轉化為新的熒光化合物，并在365 nm處檢測。

6.2.2 氣相色譜法

采用三甲基硅烷衍生或使用非衍生固定劑3%的聚碳硼烷-甲基硅氧烷(Dexsil 300)，應用OV-17 OV-25毛細管建立青霉酸氣相色譜檢測方法，青霉酸定量限為25 ng。建立了在發(fā)霉的玉米樣品中同時提取和檢測青霉酸和展青霉素的氣相色譜方法。

6.2.3 高效液相色譜法

采用高效液相色譜法將對酞內酰胺苯甲酸氯(PIB-CL)作為柱前衍生試劑對青霉酸進行衍生反應，在乙腈-水(47∶53，V/V)為流動相的條件下，采用ODS柱，紫外檢測器分離(λ=300 nm)青霉酸[39]；應用反相高效液相色譜法分離青霉酸，以乙腈-水-冰醋酸作為流動相，采用10 μm色譜柱，在紫外(UV)254 nm處進行檢測。在5～500 μg/mL的線性范圍內，青霉酸的最低檢出限為5 ng，尿和膽汁樣品加標回收率為92%～105%[40]。

6.2.4 質譜分析法

目前色譜質譜聯(lián)用在真菌毒素檢測方面的應用越來越普遍[41-43]。一種同時分析奶酪中的9種真菌毒素(黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1，赭曲霉毒素A、霉酚酸、青霉酸和婁底青霉素C)的檢測方法，該方法包括液相萃取-高效液相色譜的分析物的分離和質譜檢測，樣品加標濃度在5～200 μg/kg范圍內，青霉酸的定量限為5 μg/kg，平均回收率為96%～143%[44]；一種液相色譜串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)法同時測定小麥、大麥和燕麥中曲霉、鐮刀菌、青霉菌、麥角真菌產生的31種真菌毒素的方法，包括溶劑自動萃取、過濾、濃縮與粗提物的分析，反相色譜分離，電噴霧離子源(ESI)，多反應監(jiān)測(MRM)，負離子模式，青霉酸在小麥中的最低檢出限為15 μg/kg，定量限為35 μg/kg，平均回收率為70%～108%[45]；一種能同時測定開心果、小麥、花生、玉米、玉米片中33種霉菌毒素的液相色譜串聯(lián)質譜測定方法，反相色譜分離，電噴霧離子源(ESI)，多反應監(jiān)測(MRM)，正離子模式[46]；Vishwanath等[47]建立了一種同時測定室內基質中186種真菌和細菌代謝物的液相色譜串聯(lián)質譜測定方法，青霉酸基質抑制效應為(67±4)%，最低檢出限為38.0 μg/kg；Varga等[48]建立了一種同時測定杏仁、花生、榛子和開心果中191種真菌代謝產物的測定方法，該方法包括歐盟法典和食品法典所有規(guī)定真菌毒素，樣品用酸化乙腈-水溶液提取，提取液稀釋，直接注入UHPLC-MS/MS系統(tǒng)，正離子模式，多反應監(jiān)測。

7 青霉酸的污染防控

良好田間操作(GAP)可減少青霉酸的污染，通過良好的田間管理來抑制青霉酸的產生被認為是最有效的防控策略。青霉菌、曲霉菌容易在植物體受傷位置繁殖生長，所以防止植物體的機械或害蟲損傷能很大程度上減少青霉酸的污染。飼料中青霉酸等霉菌毒素的污染可以從多種途徑進行，加強對飼料的監(jiān)測，防止飼料原料在生產前就霉變，發(fā)現(xiàn)被污染的飼料，立即剔除；在飼料中加入足量的防霉劑，飼料中添加防霉劑是預防霉變的重要措施[49-50]。

谷物中青霉酸的產后防控策略主要是采用不同的處理方法將其高效、安全地清除，控制好飼料原料的質量、儲藏及其加工運輸過程，特別是控制好飼料的水分及高溫制粒后的降溫過程，是污染消除的關鍵。對于已經被青霉酸污染的飼料可以用物理或者化學方法加以去除。許多研究表明，通過物理、化學、生物、熱滅活、輻射等方法，可去除飼料中多種霉菌毒素或使其在不同程度下失活，如在飼料中添加可吸附霉菌毒素的物質：鋁硅酸鹽類、活性炭，沸石，酵母或酵母細胞壁成分等[51]，使毒素在經動物腸道時不被吸收，直接排出體外[52]；微生物的降解為控制青霉酸的污染提供了新的思路，可以利用微生物之間的競爭作用篩選出能抑制產毒霉菌生長的菌株，以降低青霉酸的污染[53-54]。

8 展望

青霉酸同時具有抗菌、抗腫瘤的活性[55]。青霉酸在1～25 μg/mL最小抑菌濃度(MIC)范圍內，具有較高的體外抗疫霉菌(Phytophthoraspp)活性。青霉酸能誘導辣椒疫霉菌(P.capsici)頂端分枝、菌絲體腫脹，惡疫霉菌(P.cactorum)菌絲頂端不規(guī)則分枝和小球形腫脹，栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)有不規(guī)則的分枝和腫脹，德雷疫霉(P.drechsleri)菌絲頂端或附近不規(guī)則的球形膨脹[56]。對12種植物病原細菌進行體外青霉酸抗菌活性測試，結果表明，青霉酸在12.3～111.1 μg/mL MIC值范圍內能抑制所有細菌病原體的生長；青霉酸在111.1 μg/mL和333.3 μg/mL濃度條件下能有效抑制桃離體葉片細菌性斑點病，抑制率分別為82.4%和94.1%[57]。青霉酸對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有抑制作用，青霉酸可作為農業(yè)生產中新型植物殺菌劑開發(fā)的先導分子。近年來，真菌毒素污染問題引起人們的廣泛關注，而青霉酸是霉變飼料中的高產型真菌毒素，對各種動物都具有不同程度的毒性，更應引起我們的重視。目前，研究主要集中于青霉酸的單一毒性，但在飼料及飼料原料中通常不僅僅存在青霉酸，還存在其他毒素，混和毒素的攝入對健康造成的不良影響比單一毒素的攝入風險更大。而3種或更多種真菌毒素的聯(lián)合毒性的報道較少，且真菌毒素聯(lián)合毒性的機理尚不清楚，有待進一步研究。另外，隨著人們對青霉酸毒性機理的進一步了解和對青霉酸檢測技術、脫毒方法研究的日漸深入，加強飼料防霉脫毒工作，降低對人和動物的危害，也是今后的研究方向。