馬齒莧不同溶劑提取物對(duì)核桃油的抗氧化動(dòng)力學(xué)研究

陳 凌 駱盧佳 曹巧巧 賀偉強(qiáng)

(嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)與環(huán)境分院，嘉興 314036)

核桃油味美醇香、營(yíng)養(yǎng)豐富, 含亞油酸64.6%、油酸16.3%、α-亞麻酸15.8%[1]、棕櫚酸5.6%、硬脂酸2.2% , 其中不飽和脂肪酸達(dá)91.4%[2-3]，必需脂肪酸(EFA) 質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)75.8%[4]，并且含有多種生物活性物質(zhì)；能夠降低血脂、預(yù)防心腦血管疾病、抗癌防癌、改善記憶、清除自由基[5-6]。在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的國(guó)家視核桃油為保健專用油, 近年在國(guó)際食用油市場(chǎng)上價(jià)格達(dá)10 000～12 000 美元/t, 且供不應(yīng)求。但由于核桃油富含不飽和脂肪酸, 在加工、儲(chǔ)藏及銷售過程中極易發(fā)生氧化酸敗變質(zhì)，因此其保藏就顯得尤為重要。目前，食品工業(yè)主要使用丁基羥基茴香醚(BHA)、叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)、二丁基羥基甲苯(BHT)和沒食子酸丙醋(PG) 等人工合成抗氧化劑。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，它們有一定的毒性和致癌作用，因此越來越多的國(guó)家已停止或嚴(yán)格限制使用合成抗氧化劑。馬齒莧抗氧化活性的研究主要側(cè)重于對(duì)人體的抗衰老、預(yù)防某些疾病等方面，在核桃油抗氧化的應(yīng)用還鮮見報(bào)道。因此，用藥食兩用植物馬齒莧提取抗氧化成分，研究其活性成分對(duì)核桃油的抗氧化作用，為延長(zhǎng)核桃油的貨架期和開發(fā)出新型保健食用油提供借鑒。本實(shí)驗(yàn)采用烘箱法，將不同溶劑提取的馬齒莧活性成分添加于核桃油中，通過測(cè)定不同時(shí)間的過氧化值以確定馬齒莧提取物在核桃油中的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生馬齒莧采于嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院校園內(nèi)，核桃油市場(chǎng)購置新鮮壓榨。95%酒精、葡萄糖、濃硫酸、苯酚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸氫鈉均為分析純，維生素E軟膠囊[每粒含維生素E(天然型)100 mg，輔料為明膠、甘油、精致玉米油]：浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠；蘆丁、沒食子酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Folin-Ciocalteu試劑：上海荔達(dá)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T6紫外分光光度計(jì)；JP-500B-2多功能粉碎機(jī)；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；KQ-100B超聲波清洗器；202-2A數(shù)顯電熱恒溫干燥箱；FD-4冷凍干燥機(jī)；Millipore超純水儀。

1.3 方法

1.3.1 馬齒莧活性成分的提取

新鮮馬齒莧洗凈、100 ℃殺青5 min 后70 ℃恒溫干燥，取出后粉碎，石油醚脫脂。脫脂馬齒莧粉用不同溶劑超聲波輔助提取其活性成分，提取工藝見圖1。將濾液真空濃縮后冷凍干燥，制成固體待用。

1.3.2 馬齒莧活性成分含量測(cè)定

1.3.2.1 多糖含量的測(cè)定。采用苯酚一硫酸法[7]，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程(y=0.010 8x+0.002，R2=0.998 9)。將測(cè)得的提取液的光吸收值代入回歸方程，求出樣品的多糖含量。

1.3.2.2 酚類含量的測(cè)定。采用Folin-Ciocalteu 方法，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，比色法測(cè)定其總酚的含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：用超純水溶解0.2 g沒食子酸, 定容至100 mL, 準(zhǔn)確移取1 mL稀釋到100 mL，得0.02 mg/mL沒食子酸溶液。分別移取0、1、2、3、4、5、6 mL 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，到10 mL 比色管中，加入Folin-Ciocalteu 試劑1.0 mL，混勻，3 min后加入20 g/100 mL Na2CO3溶液3 mL，用超純水定容, 置于30 ℃的恒溫水浴鍋中90 min, 顯色后于765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以超純水代替樣品為空白，以吸光度為縱坐標(biāo)，沒食子酸溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程(y=2.106 4x+0.064 4，R2=0.998 3)。

樣品中總酚含量的測(cè)定：取提取液1 mL稀釋到100 mL，再酌情稀釋，測(cè)吸光度。將其吸光度代入回歸方程計(jì)算馬齒莧提取物中總酚的含量。

1.3.2.3 黃酮含量的測(cè)定。采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法，以蘆丁為對(duì)照品，分光光度計(jì)測(cè)定馬齒莧黃酮的含量[8]。繪制蘆丁濃度與吸光度(A)的關(guān)系曲線，以吸光值對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸分析，求得回歸方程為(y=11.654x-0.006 1，R2=0.999 6)。將測(cè)得的提取液的吸光度值代入回歸方程，得到樣品黃酮含量。

圖1 馬齒莧活性成分的提取工藝流程

1.3.3 抗氧化性能實(shí)驗(yàn)

采用Schaal烘箱法，稱30 g 油脂5份置于錐形瓶中，1份為空白對(duì)照，3份分別按油重的0.01%、0.02%、0.03%添加馬齒莧活性成分(均為固體直接添加到核桃油中，除了多糖微溶外，其他提取物都溶于核桃油)，另1份按油重的0.02%添加維生素E膠囊里的液體為對(duì)比?；旌暇鶆?，置于(50±1)℃的恒溫烘箱中，每隔24 h 攪拌并檢測(cè)核桃油的過氧化物值(POV)。

1.3.4 過氧化值的測(cè)定

過氧化值按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5538—2005 的方法測(cè)定。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同溶劑提取馬齒莧活性成分的含量

用1.3.2方法測(cè)得的馬齒莧不同溶劑浸提物中活性成分(主要是黃酮、酚類和多糖)的含量見表1。3種溶劑提取物中多糖含量最高的是水提物，酚類含量最高的是丙酮提取物，黃酮含量最高的也是丙酮提取物。醇提物和丙酮提取物3種活性成分的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過100%，這是由于一些酚類本身就是黃酮，有重復(fù)計(jì)算。水提物中3種活性成分的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)不到100%，說明除了這3種成分之外的其他成分含量較多。

表1 馬齒莧不同溶劑提取物中活性成分的含量

2.2 多糖對(duì)核桃油的抗氧化性能

從圖2看出， 在(50±1)℃，所試濃度范圍內(nèi)，馬齒莧多糖對(duì)核桃油都有較好的抗氧化性， 抗氧化性活性為：0.02%>0.01%>0.04%，0.01%和0.02%的馬齒莧多糖對(duì)核桃油的抗氧化性均比0.02%VE強(qiáng)，8 d后添加0.01%的馬齒莧多糖的核桃油的POV值為0.874 mmol/kg(此時(shí)空白對(duì)照值為5.172 mmol/kg)，是空白值的16.9%；添加0.02%多糖的POV為0.822 mmol/kg，是空白值的15.9%；添加0.04%多糖的POV為1.630 mmol/kg，是空白值的35.7%；添加0.02%VE的 POV為1.071 mmol/kg，是空白值的20.7%。

多糖是由10個(gè)以上多種單糖聚合而成的天然高分子物質(zhì)，多糖類化合物具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化作用、抑制亞油酸氧化等抗氧化作用[9]。多糖對(duì)抑制脂質(zhì)過氧化的途徑主要有兩種：第一種為多糖結(jié)構(gòu)中的醇羥基與銅、鐵等金屬離子絡(luò)合，抑制羥基自由基的產(chǎn)生，影響脂質(zhì)過氧化的進(jìn)行，從而抑制活性氧的產(chǎn)生；第二種為多糖分子直接捕獲制止過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中產(chǎn)生的活性氧，阻止或減慢脂質(zhì)過氧化的順利進(jìn)行[10]。在所試條件下馬齒莧不同溶劑提取物中0.02%馬齒莧多糖對(duì)核桃油抗氧化性最好，其次為0.01%馬齒莧多糖，0.03%馬齒莧多糖對(duì)核桃油的抗氧化性較差，可能是濃度高時(shí)，互相之間形成氫鍵，其抗氧化活性位置羥基減少而降低抗氧化活性。

圖2 不同濃度馬齒莧多糖對(duì)核桃油的抗氧化活性

2.3 馬齒莧乙醇提物對(duì)核桃油的抗氧化性能

從圖3得知，0.01%和0.02%的馬齒莧醇提物對(duì)核桃油的抗氧化性都比0.02%VE強(qiáng)，抗氧化性為：0.01%>0.02%>0.03%，說明馬齒莧醇提物對(duì)核桃油的抗氧化性與馬齒莧醇提物的添加量呈負(fù)相關(guān)性。在(50±1)℃恒溫8 d后添加0.01%的馬齒莧醇提物的核桃油的POV值是空白值的19.1%，0.02%的POV值是空白值的20.6%，最差的是添加0.03%馬齒莧醇提物，其POV值為3.794 mmol/kg，是空白值的86.5%。

圖3 不同濃度馬齒莧乙醇提取物對(duì)核桃油的抗氧化活性

醇提物中含量最高的活性成分是酚類，酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)中具有化學(xué)性質(zhì)較活潑的羥基氫，可以提供氫，可與脂肪在自動(dòng)氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的游離基結(jié)合，中斷脂肪自動(dòng)氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[11]；失去氫的氧原子上未成對(duì)電子能與苯環(huán)上的π電子云發(fā)生共軛效應(yīng)，這樣，酚自由基的能量就有所降低，不再引發(fā)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而達(dá)到抑制脂質(zhì)過氧化的目的。低濃度(0.01%～0.02%)時(shí)醇提物的抗氧化性較強(qiáng)，但質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%時(shí)對(duì)核桃油的抗氧化性是所試物的濃度范圍內(nèi)最差的，這是因?yàn)橹参锒喾釉谶m宜濃度范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的抗氧化能力，但高于一定濃度后，其清除自由基能力下降，而促氧化作用逐漸增強(qiáng)[12]。

2.4 馬齒莧丙酮提物對(duì)核桃油的抗氧化性能

由圖4可知，在(50±1)℃，所試濃度范圍內(nèi)，馬齒莧丙酮提取物對(duì)核桃油的抗氧化性都比0.02%VE差，而且隨著添加量的增加對(duì)核桃油的抗氧化性減弱，8 d后添加0.01%、0.02%、0.03%的馬齒莧丙酮提取物的核桃油的POV值分別是空白值的25.5%、52.7%和78.8%，添加0.02%VE的抗氧化性是空白值的20.7%。

圖4 不同濃度馬齒莧丙酮提取物對(duì)核桃油的抗氧化活性

黃酮類化合物可作為自由基受體及鏈終止劑，過渡金屬離子(如Fe2+、Cu2+等)是自由基產(chǎn)生的催化劑，黃酮類化合物具有4-酮基，5-羥基的分子結(jié)構(gòu)，且B 環(huán)3′和4′位的連位羥基含有孤對(duì)電子[12]，因而能螯合金屬離子使其失去催化作用。馬齒莧丙酮提取物中黃酮和酚類含量是這3種溶劑提取物中最高的，同時(shí)活性成分(多糖、酚類和黃酮的總和)含量也是三者中最高的，但它對(duì)核桃油的抗氧化性與其他3種相比卻較差，因?yàn)楦邼舛葧r(shí)黃酮類物質(zhì)往往與糖縮合成“苷”，形成“苷”會(huì)明顯降低抗氧化能力[14],高濃度時(shí)黃酮和酚類不具有抗氧化作用甚至表現(xiàn)促氧化特性[15-17]。

2.5 馬齒莧水提物對(duì)核桃油的抗氧化性能

由圖5可知，在所試條件下馬齒莧水提物對(duì)核桃油都有較好的抗氧化性，添加量為0.01%和0.02%的比0.02%VE強(qiáng)，馬齒莧水提物對(duì)核桃油的抗氧化性為：0.01%>0.02%>0.03%，說明馬齒莧水提物對(duì)油脂的抗氧化性與馬齒莧水提物的添加量呈負(fù)相關(guān)性。8 d后添加0.01%、0.02%、0.03%的馬齒莧水提物的核桃油的POV值分別是空白值的19.5%、21.3%、24.7%。

圖5 不同濃度馬齒莧水提物對(duì)核桃油的抗氧化活性

馬齒莧水提物對(duì)核桃油的抗氧化效果僅次于多糖，水提物中多糖的含量為3種溶劑提取物中最高，酚類和黃酮的含量最低，且多糖、酚類和黃酮的含量最接近(見表1)，可能還與低濃度時(shí)多糖和黃酮具有協(xié)同效應(yīng)有關(guān)[18]，使得馬齒莧水提物、醇提物和丙酮提取物對(duì)核桃油的抗氧化性都隨著濃度的增加而減弱。

2.6 一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)

根據(jù)圖2～圖5中的曲線，求出每條曲線的回歸方程y=kt+b(其中y為過氧化物值、k為一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)、t為時(shí)間、b為截距)，R2為相關(guān)系數(shù)[19]，見表2。由R2值看出，馬齒莧不同溶劑提取物對(duì)核桃油的氧化性的擬一階速率常數(shù)與濃度與濃度間的線性關(guān)系均良好。速率常數(shù)k越大氧化速率越快，抗氧化效果越差。從表2得出馬齒莧提取物的抗氧化效果為：0.02%多糖>0.01%多糖>0.01%水提物>0.01%丙酮提取物>0.02%水提物>0.03%水提物>0.02%VE>0.01%醇提物>0.03%多糖>0.02%醇提物>0.02%丙酮提取物>0.03%丙酮提取物>0.03%醇提物。

表2 不同質(zhì)量濃度馬齒莧提取物對(duì)核桃油的抗氧化動(dòng)力學(xué)特性

注：時(shí)間為1～8 d。

3 結(jié)論

在所試濃度范圍內(nèi)，(50±1)℃，1～8 d的核桃油抗氧化實(shí)驗(yàn)中，馬齒莧多糖、馬齒莧水提物、馬齒莧醇提物和馬齒莧丙酮提取物對(duì)核桃油都具有抗氧化性。總體來看馬齒莧多糖對(duì)核桃油的抗氧化性最好，其次是馬齒莧水提物，再其次是醇提物，最差的是馬齒莧丙酮提取物。0.01%～0.03%水提物、0.01%～0.02%多糖和0.01%乙醇提取物對(duì)核桃油的抗氧化性都優(yōu)于VE。除馬齒莧多糖外，馬齒莧水提物、醇提物和丙酮提取物對(duì)核桃油的抗氧化性都隨著濃度的增加而減弱。