干細胞誘導內(nèi)耳相關(guān)細胞再生的研究進展

石琳鈺 陳始明

聽覺系統(tǒng)的復雜性使聽力容易受到損傷[1, 2]。過度的聽覺刺激、耳毒性藥物的使用或局部缺血缺氧等因素可引起毛細胞(hair cell，HC)及與之相連的神經(jīng)元受損，導致感音神經(jīng)性聾(sensorineural hearing loss，SNHL)[3～8]。SNHL是一種發(fā)病率很高的全球性疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，其影響了全球約3.6億人口[9]。雖然現(xiàn)在助聽器佩戴和人工耳蝸植入等手段為大多數(shù)此類患者提供了治療的選擇，但這些治療手段也存在明顯的局限性，比如需要佩戴外部裝置、費用昂貴等。隨著對聽力受損機制研究的不斷深入，越來越多的研究顯示干細胞(stem sell，SC)移植治療SNHL具有潛在的可行性[10]。

SC是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞，其可獲取周圍環(huán)境信息定向分化成不同特異性表型的細胞，使其在分化成新的功能細胞以替代病變或衰老的細胞方面存在巨大的應(yīng)用潛能[10]。在SNHL研究方面，已發(fā)現(xiàn)SC可分化成新的HC及神經(jīng)元等細胞，這為干細胞移植以取代部分病變的內(nèi)耳相關(guān)細胞提供了可行的選擇[11]。本文就不同種類干細胞移植誘導內(nèi)耳相關(guān)細胞再生的研究進展進行綜述，對目前研究存在的局限及未來的研究方向進行展望。

1 胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)

體外研究表明，鼠SC可以誘導逐步分化為內(nèi)耳的HC和螺旋神經(jīng)節(jié)(spiral ganglion neurons，SGN)細胞[12]。從ESCs產(chǎn)生內(nèi)耳HCs和SGNs的重點在于找到合適的培養(yǎng)方案誘導SC分化為HC或/和SGN細胞，并證明分化產(chǎn)生的細胞具有相應(yīng)的生理功能。

Oshima等[13]發(fā)現(xiàn)ESCs可以誘導生成具有功能的HC，其誘導ESCs得到的類HC中含有毛細血管團和與天然前庭HC類似的激肽釋放酶，并表達許多HC相關(guān)標記物且顯示出對機械作用的敏感性；該研究進一步體外使用FBS、胰島素樣生長因子-1、Dkk1(Wnt信號抑制劑)、SIS3(Smad3抑制劑)以及FGF2刺激ESCs，最終得到類HC。但這種培養(yǎng)方式必須在有絲分裂的雞囊細胞層上進行，這種對外源組織的需求限制了該法的常規(guī)使用。另外，該研究報道HC的誘導效率較低，僅占細胞總數(shù)的1%～2%。

隨后出現(xiàn)的3D培養(yǎng)系統(tǒng)避免了外源性組織的限制。Koehler等[14]通過使用KSP(培養(yǎng)基補充劑)、BMP4、TGF-β、SB(TGF-β抑制劑)、LDN(BMP抑制劑)、TGF2等因子建立了3D培養(yǎng)系統(tǒng)。在整個培養(yǎng)過程中精確把握各個階段的處理時機以及SC發(fā)生的各種形態(tài)轉(zhuǎn)變，最終，在含有細胞外基質(zhì)蛋白的培養(yǎng)基中，ESC誘導分化成內(nèi)耳HC、支持細胞和前庭感覺神經(jīng)元樣細胞，同時還觀察到分化形成的感覺神經(jīng)元樣細胞與衍生的HC形成了特殊的突觸連接。DeJonge等[15]在3D培養(yǎng)系統(tǒng)中對ESC分化過程進行研究發(fā)現(xiàn)，加入強效Wnt激動劑調(diào)節(jié)Wnt信號傳導通路可以增強內(nèi)耳感覺細胞的分化。

由ESCs分化為HC的培養(yǎng)方案中，除應(yīng)用外來細胞因子調(diào)控分化進程外，細胞自身基因也在其中發(fā)揮重要作用。體內(nèi)內(nèi)耳器官發(fā)育過程中有兩個關(guān)鍵點：向非神經(jīng)外胚層分化點和耳基板分化點。在形成耳基板時，內(nèi)耳膜迷路所發(fā)生的外胚層中，F(xiàn)GF信號傳導導致轉(zhuǎn)錄因子Pax2上調(diào)[16]。Schaefer等[17]使用攜帶Pax2EGFP等位基因的小鼠作為實驗組，其中EGFP插入Pax2翻譯起始位點上游，相同遺傳背景的野生型(WT)小鼠作為對照組；挑選出Pax2 EGFP/+基因型的子代并從已孕雌性小鼠中獲得ESCs，體外誘導培養(yǎng)獲得的ESCs結(jié)果顯示，從建立的突變小鼠中獲取的ESCs可以最終分化為成熟的HC，Pax2EGFP等位基因是驗證干細胞是否分化為成熟HC的較好實驗手段。

SNHL患者內(nèi)耳HC再生后同樣要求建立完整的神經(jīng)支配以實現(xiàn)其功能。不同于分化為HC的培養(yǎng)方法，Perny等[18]模擬體內(nèi)內(nèi)耳發(fā)育的最重要步驟，開發(fā)了基于類器官培養(yǎng)系統(tǒng)的具體分化方案，用來指導小鼠ESC向耳感覺神經(jīng)元(OSN)的分化。在無血清條件下，該研究團隊在基質(zhì)膠中使用快速聚集方法啟動ESCs向外胚層逐步分化，然后通過激活BMP信號傳導并抑制TGFβ信號傳導以防止內(nèi)胚層的誘導，從而誘導非神經(jīng)外胚層。Perny等[18]通過抑制BMP信號傳導和添加FGF2進一步誘導出基板前體和耳基板外胚層，補充腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3)用于OSN細胞進一步分化成熟，最終培養(yǎng)出具有明顯雙極形態(tài)和功能興奮性的大量神經(jīng)元；隨后他們檢測發(fā)現(xiàn)ESC衍生的OSN顯示出天然SGN的功能性電生理學特性。

上述研究在使用細胞培養(yǎng)技術(shù)來誘導ESC分化產(chǎn)生內(nèi)耳相關(guān)細胞方面取得了較大的進展；然而，因誘導效率問題尚未解決，培養(yǎng)的結(jié)果仍不令人滿意。現(xiàn)有多種培養(yǎng)方案可誘導ESCs分化為HC和神經(jīng)元細胞，但分化過程中的關(guān)鍵基因、細胞因子以及培養(yǎng)方式的選擇等仍需進一步優(yōu)化；而且，除定向分化為所需的目的細胞外，還要盡可能提高分化效率。

2 神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)

耳蝸NSCs耳內(nèi)移植治療SNHL是另一種有潛力的方法[20]；它們不僅可以增強內(nèi)耳神經(jīng)元的分化和存活，還支持耳蝸HC的再生[21]。在體實驗表明，NSCs可以用來再生并替代失去的神經(jīng)元。將NSCs成功移植到小鼠內(nèi)耳后發(fā)現(xiàn)，移植的細胞存活數(shù)周后即表達了神經(jīng)膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元細胞和HC的標記物，并在失神經(jīng)耳蝸(denervated cochleae)中與HCs形成了細胞連接[22～24]。Hu等[25]將耳蝸軸打開并將聽神經(jīng)纖維完全切斷，然后將NSCs移植到聽神經(jīng)纖維的斷端，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NSCs不僅可沿著內(nèi)聽道的聽神經(jīng)纖維遷移，還進一步向中樞方向遷移，到達腦干并臨近耳蝸腹核。對于SNHL的治療，由于一些細胞因子、生長因子以及酶類等大分子在通過血腦屏障時會受到障礙，因此在應(yīng)用時會有一定的限制。神經(jīng)再生中，除雪旺細胞外，基底膜及神經(jīng)生長因子都是必不可少的因素。易天華等[26]認為NSCs移植到神經(jīng)損傷區(qū)域后，在分化生長為雪旺細胞的同時還可分泌一些有利于神經(jīng)生長的因子，所以采用NSCs細胞替代療法治療神經(jīng)褪變不僅能夠順利通過血腦屏障，且在耳蝸中移植更直接有效。對于人工耳蝸植入者必須有最低限度數(shù)目的SGN細胞存活，才能保證相對好的移植后聽覺識別能力。目前的研究重點是尋找促進NSC增殖和神經(jīng)分化的方法或藥物，這可能極大地促進基于干細胞治療SNHL的發(fā)展。

目前用SC或祖細胞移植再生或恢復神經(jīng)損傷的動物研究已經(jīng)證實NSCs臨床應(yīng)用的可能性。然而，其再生機制尚不清楚，目前存在的疑問有：①是否由通過移植的細胞直接替換受損細胞？②是否由移植的細胞旁分泌所釋放的細胞因子、生長因子和激素作用于原先存在的細胞從而產(chǎn)生新的神經(jīng)細胞？這可能是今后的研究方向之一。

3 間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)

MSC具有自我修復、自我更新、高度增殖分化潛能和貼壁生長的特點，通過特定的誘導可向骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞、神經(jīng)細胞和上皮細胞轉(zhuǎn)化[27]。MSC有多種來源，例如：骨髓、脂肪、肝臟、羊水、胎盤、臍帶和牙齒等[28]，其優(yōu)勢在于高擴增潛力、遺傳穩(wěn)定性、易于從實驗室收集、易遷移至受損部位的能力和自體或異體移植中強大的免疫抑制特性等。目前分別有來自骨髓、臍帶和脂肪來源的MSC誘導分化成內(nèi)耳相關(guān)細胞的研究報道。

Matsuoka等[29]認為替代丟失的SGN神經(jīng)元的可能候選干細胞是骨髓衍生的MSC，其通過沙鼠動物實驗直接將BMSC注射到受損耳蝸的蝸軸中發(fā)現(xiàn)這些干細胞最終被成功移植，且移植后存活的MSCs可能會導致受損的SGNs再生，促進聽功能的恢復。在特定的生長因子如視黃酸存在時，BMSCs可分化為感覺神經(jīng)元[30, 31]。Lee等[32]在大鼠BMSC的培養(yǎng)基中加入膠質(zhì)細胞衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、BDNF和NT-3等，結(jié)果顯示BMSC可分化為神經(jīng)元祖細胞并進一步分化為神經(jīng)元細胞。BMSC除可分化為神經(jīng)元細胞外還可分化為HC。Mahmoudian-Sani等[33]發(fā)現(xiàn)人BMSCs可以通過RA、bFGF和EGF的作用分化成類HC樣細胞，其細胞形態(tài)未發(fā)生改變，但qRT-PCR檢測出 SOX2、POU4F3、ATOH1表達水平明顯上調(diào)，而這3種基因在耳蝸HC的發(fā)育和存活中發(fā)揮重要作用。哺乳動物耳蝸間質(zhì)非感覺區(qū)的耳蝸纖維細胞在維持正常聽力中發(fā)揮重要作用。Kamiya等[34]建立了由線粒體毒素誘導的、纖維細胞功能障礙引起的急性感音神經(jīng)性聽力損失的大鼠模型，將BMSC移植到該模型動物的外半規(guī)管中，通過ABR檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，移植BMSC后大鼠的聽力明顯提高。上述研究結(jié)果表明BMSC可成功移植于耳蝸，并可能提高部分聽功能。雖然其發(fā)揮作用的具體機制仍不清楚，但其潛在的應(yīng)用前景已經(jīng)非常明顯。

人臍帶細胞即Wharton’s Jelly 細胞，也稱為人臍帶間充質(zhì)基質(zhì)細胞(hUCMSCs)，是另一個MSCs的優(yōu)良來源[35]。hUCMSCs的主要優(yōu)點之一是它們保留了從所有三個胚層分化成多種細胞類型的能力[35]。用表達Atoh1的載體處理這些hUCMSC，可以誘導其分化成表達HC特異性標記的HC樣細胞[36]，使其成為治療SNHL和平衡障礙的候選者之一。

據(jù)報道，脂肪組織來源的MSCs(adipose-derived stem cells， ASCs)可以遷移到組織損傷部位并分泌營養(yǎng)因子[37]，這使其也成為MSC的組織來源候選者之一。Fetoni等[37]對自身免疫性聾的豚鼠全身輸注ASCs后發(fā)現(xiàn)ASCs可從外淋巴管遷移到內(nèi)淋巴管；且在噪聲暴露下，移植了ASCs的豚鼠耳蝸組織中與PDGF、VEGF和TGF-β途徑相關(guān)的趨化因子配體和受體的表達明顯增加。雖然在整個實驗過程中，ASCs移植并沒有改善豚鼠的聽功能，但也沒有引起任何額外的聽力損失；另外，研究發(fā)現(xiàn)ASCs可誘導脾細胞中抗炎細胞因子IL-10的產(chǎn)生，同時誘導產(chǎn)生CD4+、CD25+、Foxp3+Treg細胞，從而抑制自身抗原特異性T細胞應(yīng)答，增強免疫抑制性[38]。因此，ASCs是干細胞移植的可能選擇之一，因它的高可塑性、營養(yǎng)特性以及免疫抑制特性，局部注射可與常規(guī)療法(如人工耳蝸植入)相結(jié)合，以增強損傷早期的內(nèi)源性修復過程并促進聽功能的恢復[39]。

以上幾項動物研究已證實成功接種MSC后，MSC可以分化為類HC和SGN細胞，并可部分恢復受損的聽力，或通過營養(yǎng)作用等保護已受損細胞，但MSC是否可以應(yīng)用于人類聽力損失的治療仍需臨床研究進一步來驗證。因此，Lee等[40]針對SNHL患者進行了兩項臨床試驗，其中一例患有聽神經(jīng)病，另一例患者則是顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤開顱術(shù)后因眶周痙攣行微血管減壓術(shù)后出現(xiàn)了聽力障礙，通過自體BMSC移植治療后，這2例患者均未找到與干細胞移植相關(guān)的任何并發(fā)癥和副作用，且在隨訪的12個月內(nèi)純音測聽、耳聲發(fā)射和ABR監(jiān)測均未出現(xiàn)任何改變；在輸注MSC治療3年后，患者未出現(xiàn)任何并發(fā)癥；該試驗驗證了SNHL患者自體BMSC治療的安全性，但其治療效果有待提高。

4 誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)

iPSCs與ESCs在分子結(jié)構(gòu)和功能特征上非常相似，并且是多能干細胞的新來源。目前認為體細胞工程可以產(chǎn)生幾乎所有細胞類型的首選方法之一就是iPSC[41]。

Ohnishi等[42]報告僅用bFGF在無血清的培養(yǎng)基中誘導iPSC 71天后可成功分化為HC樣細胞團，通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)產(chǎn)生的細胞類型有上皮樣細胞和神經(jīng)元樣細胞，且少數(shù)上皮樣細胞頂端可以觀察到靜纖毛樣突起。Koehler等[43]也通過體外細胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)出類HC樣細胞。與Ohnishi等不同的是，Koehler等不是使用單一的誘導因子而是采用3D培養(yǎng)系統(tǒng)，通過加入TGF、BMP、FGF和Wnt信號因子從單個iPSC聚集體誘導產(chǎn)生多個耳泡狀結(jié)構(gòu)。通過檢測，這些耳泡狀結(jié)構(gòu)均表現(xiàn)出與天然感覺HC相似的電生理學特征。

MYO15A基因突變與部分亞洲和歐洲家庭中的重度先天性感音神經(jīng)性聾有關(guān)[44]，而 MYO15A是非常規(guī)肌球蛋白超家族中一員，并且是HC中靜纖毛正常發(fā)育所必需的蛋白[45]。Chen 等[46]從MYO15A c.4642G4A和c.8374G4A突變的家族成員中獲得iPSC，并成功誘導iPSC分化為HC樣細胞，然后應(yīng)用CRISPR / Cas9技術(shù)和靶向載體兩種形式的同源重組模板來修復iPSC中的MYO15A c.4642G4A突變，最終發(fā)現(xiàn)此種方法可以修復MYO15A基因突變導致HC樣細胞的表型異常和功能障礙。該試驗證明了人iPSC產(chǎn)生內(nèi)耳HC的可行性以及遺傳校正對基因突變所致的耳聾具有一定的治療意義。

體外實驗顯示iPSC可被誘導產(chǎn)生HC和神經(jīng)元樣細胞。Ishikawa等[47]通過3D培養(yǎng)法誘導iPSC最終分化為神經(jīng)元，并將iPSC衍生的神經(jīng)元移植到豚鼠耳蝸。在豚鼠的炎癥反應(yīng)得到適當控制時，移植的谷氨酸能神經(jīng)元在耳蝸中存活[47]。證實iPSC體外誘導產(chǎn)生的神經(jīng)元細胞可在體移植成功，但該研究未檢測移植成功的神經(jīng)元是否有助于聽功能的恢復。在另一項類似研究中，Gokcan等[48]通過動物實驗未發(fā)現(xiàn)iPSCs移植具有明顯的治療效果，其通過耳后入路行耳蝸造口術(shù)，人為破壞大鼠的內(nèi)耳結(jié)構(gòu)，并在已受損的耳蝸內(nèi)注入iPSC；注射iPSC前后分別用ABR評估聽功能，并在大鼠處死后提取耳蝸組織觀察內(nèi)耳中iPSC的生物學行為，最終未發(fā)現(xiàn)iPSC有明顯的治療作用。

5 其他類型的干細胞

除上述研究較多的干細胞類型外，還有部分所知甚少的干細胞種類，例如：內(nèi)耳干細胞[49]、成人干細胞[41]、造血干細胞[22]等。內(nèi)耳干細胞群體(inner ear stem cells)被發(fā)現(xiàn)于人胎兒的耳蝸中，這些細胞保留了SC細胞標志物(Nestin，Sox2，Oct4和Rex1)的表達，可以在幾個月內(nèi)快速增殖，通過特殊培養(yǎng)后呈現(xiàn)出SGN和HC細胞的特征[49]。這些干細胞可通過直接整合入受損組織并繼續(xù)分化后置換受損的HC和SGN細胞，可能有助于恢復內(nèi)耳感覺細胞及其感覺神經(jīng)節(jié)[41]。目前已用于內(nèi)耳再生的成人SC有來自骨髓的造血SC、間充質(zhì)SC和神經(jīng)元SC。但現(xiàn)有對干細胞的分類標準尚沒有統(tǒng)一，所以成人干細胞的研究范圍即與MSC、NSC等重合。有關(guān)造血干細胞誘導分化成內(nèi)耳相關(guān)細胞方面的研究較少，Okano等[22]發(fā)現(xiàn)通過加入生長因子和轉(zhuǎn)錄因子Atoh1，骨髓來源的CD133 + SC可以分化為具有HC特征的細胞，然而，分化產(chǎn)生的細胞沒有表現(xiàn)出促進聽功能恢復的現(xiàn)象。

6 總結(jié)與展望

目前研究已發(fā)現(xiàn)多種干細胞，如：ESC、MSC、NSC、iPSC等均可以在細胞實驗或部分動物實驗中表現(xiàn)出分化為耳蝸HC和SGN樣細胞，分化后的細胞具有HC和神經(jīng)細胞的相關(guān)特征；部分研究還發(fā)現(xiàn)分化的細胞可整合出現(xiàn)類似內(nèi)耳的組織，因此干細胞誘導分化成內(nèi)耳相關(guān)細胞治療SNHL值得期待。未來需要著力解決的問題是干細胞類型的選擇、干細胞移植的最佳微環(huán)境、誘導分化劑及誘導作用時間等。