外源性線粒體植入治療線粒體疾病的研究進展*

齊悅 龔樹生

線粒體是細胞有氧呼吸的主要場所，為細胞和組織提供生命活動所必需的能量，是人類最重要的細胞器之一。線粒體在葡萄糖和脂肪的代謝，氧化磷酸化及細胞凋亡等過程中發(fā)揮著至關重要的作用[1，2]，線粒體功能的異常可導致老化[3]及多器官多系統(tǒng)的疾病[4，5]。線粒體基因不受組蛋白保護，因此具有高突變率[6]，常導致母系遺傳的先天性疾??；此外，線粒體也是最易受環(huán)境有害因素攻擊的細胞器之一，目前研究證實線粒體功能障礙與心血管疾病[7]、肥胖[8]、糖尿病[9]、神經(jīng)系統(tǒng)和肌退行性疾病[10，11]、綜合征型和非綜合征型耳聾[12，13]等多種常見病以及部分罕見病[14]相關。

目前臨床上尚無有效的治療方法治愈線粒體疾病。近年來，通過植入外源性線粒體或外源性線粒體DNA糾正先天性線粒體遺傳病及后天性線粒體功能障礙成為新的研究熱點。2016年，Kang等[15]成功地通過線粒體置換技術對人卵母細胞的線粒體DNA 致病突變進行糾正，這項研究成為線粒體遺傳病治療上的重大突破；然而無論是技術難度，還是涉及的倫理問題和潛在的重大風險都使其難以在臨床上推廣。最新研究發(fā)現(xiàn)在成熟的體細胞周圍植入外源性線粒體，也可使線粒體功能缺陷的細胞和組織恢復線粒體功能[16]；這種外源性線粒體的植入主要有兩種，即植入攜帶正常線粒體的細胞和植入獨立的功能性線粒體。外源性線粒體植入的治療作用已在多種線粒體疾病動物模型上得以證實[17，18]，為線粒體疾病提供了一種新的治療方向。本文對外源性線粒體植入的相關研究進展進行綜述，旨在探討外源性線粒體植入對線粒體疾病的治療效果及作用機制，并為其應用于線粒體聾病的治療提供理論依據(jù)。

1 外源性細胞內線粒體的跨細胞轉運及治療意義

2006年，Spees等[16]對是否能通過植入外源性線粒體或線粒體DNA(mtDNA)，使其跨細胞轉移進入無線粒體功能的細胞并進行線粒體功能修復進行了研究，研究通過溴化乙錠使細胞的mtDNA產生突變并喪失功能，成為無法有氧呼吸和生長的A549細胞，然后將人骨髓非造血祖細胞(stem/progenitor cells from human bone marrow，hMSCs)和成纖維細胞分別與這種線粒體缺陷的A549細胞共孵育，結果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)出了攜帶有功能線粒體的A549細胞，這些功能線粒體來自于hMSCs和成纖維細胞，提示細胞間出現(xiàn)了線粒體的跨細胞轉移并可恢復A549細胞的有氧呼吸功能。這種通過獲取其他類型細胞的外源性線粒體來恢復細胞自身線粒體缺陷的現(xiàn)象，隨后在Tan等[19]的動物在體實驗中也得到了證實，2014年Tan等將缺乏mtDNA的腫瘤細胞皮下注射到同種系小鼠后，這些原本喪失了增殖功能的腫瘤細胞逐漸恢復了增殖能力，研究在增殖的腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)了宿主小鼠的mtDNA及具有功能的線粒體。

在離體細胞培養(yǎng)實驗中已有研究證實了骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived stromal cells，BMSCs)可將正常的線粒體轉移到有線粒體缺陷的內皮細胞、A549細胞以及心肌細胞[16，20，21]，但在活體肺中，外源性BMSCs的線粒體轉移及其潛在的治療效果尚待研究；Islam等[18]建立了急性肺損傷的動物模型，并對活體肺灌注健康的BMSCs，發(fā)現(xiàn)灌注的BMSC首先附著于肺泡，在隨后的24小時內BMSC將線粒體逐漸的轉移到肺泡上皮細胞，并顯著增加了肺泡的ATP水平，對肺組織的急性期損傷可起到積極的保護作用。

隨著研究的進展，這種外源性線粒體的跨細胞轉運在越來越多的細胞類型中被發(fā)現(xiàn)和證實。在Robicsek等[22]的研究中，外源性線粒體可以自發(fā)的進入多種類型細胞，繼而可改善受體細胞受損的線粒體功能，這種外源性線粒體進入不同類型細胞的過程常在數(shù)分鐘內即可完成。上述研究結果提示線粒體的跨細胞轉運并不是某種細胞特有的功能，而可能是細胞普遍具有的能力。

2 孤立外源性線粒體的跨細胞轉運及治療意義

相對于細胞而言，注射直徑僅4～6 nm大小的線粒體可顯著減少因注射而造成的機體損傷，并且可減少免疫排斥反應，更適宜應用于在體研究。目前研究已證實，局部缺血可導致線粒體損傷和功能障礙，這些受損的線粒體在再灌注過程中會對細胞生存產生負面影響[23，24]。為了減少這種負面影響，2008年McCully等[17]從未受損的兔心肌組織分離提取出了形態(tài)完整且具有功能的孤立線粒體，將其直接注射到自體缺血的心肌組織中，2小時后的檢測結果顯示注射的外源性線粒體仍存活并保持著完好的膜電位和功能，同時有效的減少了肌酸激酶、肌鈣蛋白Ⅰ等反映心肌損傷的指標和心肌的梗死面積，并且沒有造成心律失常等不良反應；然而，這項研究中注入的外源性線粒體聚集在心外膜表面的心肌纖維間而沒有進入肌細胞。2013年Masuzawa等[25]在該項研究的基礎上采用上述方法從兔胸大肌組織中分離出具有功能的孤立線粒體，并直接注射到自體缺血的心肌組織,和前述研究相比，該研究延長了注射后的線粒體觀測時間，發(fā)現(xiàn)移植的外源性線粒體先在心肌細胞間隙明顯聚集，2 h后附著在心肌細胞表面，在移植后的8～24小時外源性線粒體逐漸被整合到心肌細胞中被心肌細胞所內化，進而減少心肌細胞的凋亡和心肌梗死面積。同年，Lin等[26]將分離出的外源性線粒體用于減輕大鼠缺血再灌注的肝損傷,缺血后再灌注損傷是肝移植和肝切除術面臨的一個臨床難題;該研究從鼠的肝細胞中分離出獨立的線粒體并注射到脾囊膜區(qū)域，這些外源性線粒體經(jīng)脾靜脈回流進入肝臟門脈系統(tǒng)最終到達缺血后再灌注的肝區(qū)；植入后的240 min，外源性線粒體在受體動物肝細胞中仍保持著完整膜電位，明顯的減輕了再灌注后的肝組織損傷，減少了氧化應激和細胞死亡。上述研究提示，孤立的外源性線粒體植入可應用于減少多臟器的缺血再灌注損傷；減少缺血后的再灌注損傷不僅在治療缺血性疾病中有重要的臨床治療價值，也對組織及器官移植等手術中減少機體損傷有著重要的意義。除了應用于減少多臟器的缺血再灌注損傷外，外源性線粒體植入在精神分裂癥[22]、阿爾茲海默癥[27]、帕金森病[28]等神經(jīng)系統(tǒng)疾病動物模型中的治療作用也得到了證實。

研究已證明植入外源性線粒體對線粒體受損的腦、心臟、肝臟和肺組織等有治療作用，以上研究均采用的是自體或同種系動物的外源性線粒體進行移植，而將源自不同種屬動物的線粒體移植到受損宿主組織是否也能保持外源性線粒體的存活并起到類似的治療作用？為了解答這一問題，2016年Huang等[29]從倉鼠細胞系中提取出有功能的線粒體，通過腦內或系統(tǒng)內動脈注射的方式將這些分離出來的外源性線粒體植入缺血的大鼠腦組織(主要是大腦皮層神經(jīng)元)，結果發(fā)現(xiàn)這些源于倉鼠的線粒體也能恢復腦缺血大鼠的運動性能，可顯著減少腦梗死區(qū)域和神經(jīng)元細胞死亡數(shù)量；該研究在腦缺血大鼠的神經(jīng)元和星形膠質細胞中都觀察到了內化的倉鼠線粒體。這些結果強調異種外源性線粒體也可以有效地對抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的急性缺血性損傷，同時研究還發(fā)現(xiàn)，細胞中分離的外源性線粒體不僅能對抗急性損傷，也能對腦組織有長期保護作用。不僅來源于異種屬動物的線粒體可以通過跨細胞轉運進入受體細胞，從植物(如雪松等)葉子中分離出的線粒體也可以在30分鐘內進入人體細胞并保持有活性[28]。

關于外源性線粒體植入的途徑，在臨床上直接進行上述的心臟注射、腦區(qū)注射或脾臟注射存在諸多風險。最近的一項動物實驗證明[28]，靜脈注射有活性的外源性線粒體后，小鼠的多種不同組織(如腦、肝臟、腎臟、肌肉和心臟)中均可檢測到有功能的外源性線粒體，并同樣具有治療作用。在Shi等[28]的研究中，通過靜脈注射的這些外源性線粒體不僅增加了正常的小鼠耐力，也通過增加電子傳遞鏈的活動，減少ROS水平，防止細胞凋亡和壞死，進而阻止了帕金森病(Parkinson's disease，PD)小鼠疾病的進展；同時，研究還對血液中的紅細胞進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)外源性線粒體并未進入到成熟的紅細胞，成熟的紅細胞不具有線粒體，因而可避免在運輸氧的過程中耗氧，因此，這種靜脈注射外源性線粒體的治療方法不會影響紅細胞運輸氧的功能。上述研究表明通過靜脈注射進行外源性線粒體植入可能是一種更為安全、有效且易于實施的植入方式。

3 外源性線粒體跨細胞轉運的機制

植入攜帶有線粒體的外源性細胞或者孤立的外源性線粒體，已被證實可在多種細胞自發(fā)的進行跨細胞轉運。然而，這種外源性線粒體的跨細胞轉運機制尚不明確，目前研究認為細胞融合、各種細胞間的細胞質橋接以及分泌囊泡外泌體等可能是其機制。

在植入攜帶外源性線粒體細胞的研究中，首先需要明確的是線粒體是以完整的線粒體形式還是mtDNA形式從植入的外源性細胞進入受體細胞。Cho等[30]通過線粒體內膜染料R6G對完整的外源性線粒體進行標記，結果表明受體細胞恢復線粒體功能是由于完整的線粒體轉移，而不僅僅是mtDNA轉移。對于其轉移機制的研究，Spees等[16]將hMSCs和成纖維細胞分別與線粒體缺陷的A549細胞共孵育，為了確認線粒體從hMSCs和成纖維細胞轉移到A549細胞的過程是否發(fā)生了細胞融合，分析了核DNA和mtDNA，發(fā)現(xiàn)A549細胞中出現(xiàn)了hMSCs或成纖維細胞這兩種供體細胞的mtDNA，但沒有檢測到來自供體細胞的核DNA。這項研究結果提示線粒體的這種細胞間轉運并不依賴于細胞融合。

隧道納米管是Rustom等在鼠嗜鉻細胞瘤(PC12)細胞中發(fā)現(xiàn)的一種新的細胞間通信途徑。2004年Rustom等[31]首次描述并將這種細胞間通信途徑命名為隧道納米管(tunneling nanotubes，TNT),掃描電鏡下可見TNT是細胞間形成的一種膜狀細胞橋，可直接連接相鄰細胞。迄今為止，檢測到TNT的細胞類型的數(shù)量在不斷增加[32]，提示TNT可能是細胞間通信的一種普遍存在的機制。在不同類型的細胞中，TNT結構具有多樣性，但又具有相似的特征；目前研究證實，TNT在數(shù)分鐘內就可形成，直徑50～200納米，長度可達數(shù)個細胞直徑，結構上有纖維狀肌動蛋白(f-actin)而無微管[31]，為一種細胞向鄰近細胞發(fā)出的突起，形態(tài)上類似于絲狀物，可在離它們最近的距離上動態(tài)連接細胞。TNT已被證實可在細胞間轉運多種細胞成分，如轉移膜相關的細胞器、線粒體、溶酶體等[33～35]。

除了形成納米管外，分泌微泡也被認為是線粒體跨細胞轉運的重要機制之一。Islam等[18]將BMSCs灌注到肺組織的研究中發(fā)現(xiàn)，健康的BMSCs在附著于損傷的肺泡上皮后，形成了納米管并釋放出了微泡，且在這種微泡中檢測到了源于BMSCs的正常線粒體，該研究認為BMSCs釋放的微泡被上皮細胞吸收可能是導致線粒體跨細胞轉運的原因之一。

先前的研究已經(jīng)提出了隧道納米管或其他細胞間連接的參與可能是外源性線粒體細胞間轉運的機制，然而，植入孤立外源性線粒體的相關研究并不支持隧道納米管是其進入細胞的機制。Masuzawa等[25]在心肌細胞周圍植入自體線粒體后并沒有觀察到心肌細胞出現(xiàn)細胞延伸，表明通過隧道納米管進行的線粒體吸收雖然在細胞間轉移中表現(xiàn)出來，但可能不會在細胞器-細胞轉移中發(fā)揮作用。孤立的外源線粒體被受體細胞吸收的機制可能是通過內吞作用的途徑，2018年Robicsek等[22]對這種孤立的外源性線粒體進入細胞的機制進行了探討，認為依賴于肌動蛋白的胞飲作用是最有可能的作用方式。細胞的大胞飲是一種細胞表面進行的內吞活動，可以通過吸收0.5～1 μm大小的細胞外顆粒來進行跨細胞交流[36，37]。目前這一機制的推測尚缺乏足夠的證據(jù)，仍有待于進一步的研究來證實。

4 外源性線粒體植入治療線粒體聾病的應用前景

線粒體基因和功能的異?？蓪е露喾N類型的感音神經(jīng)性聾，迄今為止已有多種線粒體突變被證實是先天性聾和后天獲得性聾的致病機制[38，39]。線粒體聾病可表現(xiàn)為伴有其他臨床癥狀的綜合征型耳聾和不伴有其他任何臨床癥狀的非綜合征型耳聾。由于耳蝸細胞線粒體是藥物、缺氧、噪聲等多種有害因素攻擊的主要靶點之一，耳蝸細胞線粒體的功能障礙已被證實與藥物性聾、噪聲性聾等多種類型的感音神經(jīng)性聾有關[38，40]。臨床上常見的線粒體12SrRNA基因的A1555G突變和C1494T突變，即是氨基糖苷類抗生素致聾的常見病因。耳蝸細胞線粒體還與老年性聾密切相關，細胞衰老過程中mtDNA突變不斷發(fā)生和積累，目前研究已在老年性聾的動物模型中驗證了mtDNA缺失與年齡相關性耳聾之間具有明顯相關性[41]。

迄今為止線粒體聾病尚缺乏有效的治療方法。臨床上主要通過對遺傳性線粒體聾病患者進行產前基因檢測和指導，避免攜帶有線粒體mtDNA致病突變的個體出生。然而，這種篩查涉及的突變位點有限，目前僅有C1494T突變和A1555G突變等少數(shù)線粒體突變位點可被檢測[42]。先天性及后天獲得性線粒體聾病一旦發(fā)生，便無法治愈，因此亟待尋找一種新的線粒體治療方法糾正耳蝸細胞的線粒體功能、治療線粒體聾病。目前外源性線粒體植入已在心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等動物模型上證實了治療效果，如果外源性線粒體也能進入受損的耳蝸細胞并保持活性，進而使耳蝸細胞恢復線粒體功能，那么有望在治療線粒體聾病方面取得突破性進展。

然而，外源性線粒體植入應用于在體的耳蝸細胞尚存在諸多問題，如：耳蝸位于顳骨深部，血供遠不如心臟、肝臟及腦組織等豐富，通過靜脈注射途徑植入的外源性線粒體是否能夠到達耳蝸細胞周圍尚存在疑問，因此，圓窗給藥或后半規(guī)管的局部注射可能是更適合耳蝸植入外源性線粒體的途徑。同時，植入外源性線粒體也存在潛在的風險。在前述研究中植入有活性的外源性線粒體并未發(fā)現(xiàn)對細胞及機體造成負面影響，但植入的線粒體一旦失活則會引發(fā)機體的炎性損傷。2016年Wilkins等[43]將孤立的線粒體及分離出的線粒體DNA進行冰凍滅活，隨后通過注射植入到C57BL/6小鼠的海馬體內，7天后在海馬體檢測到了大量炎性標記物，研究發(fā)現(xiàn)這些失活的線粒體或線粒體成分可誘發(fā)神經(jīng)炎癥；因此，保證植入線粒體的完整性和活性十分關鍵。

盡管存在諸多風險和困難，外源性線粒體植入仍為線粒體病的治愈提供了一種新的獨特的治療策略，可從根本上糾正線粒體的遺傳異常和功能缺陷，有望成為一種新的有效的治療手段，與其他臨床干預措施相結合或單獨應用于線粒體聾病的治療。