基于熒光定量PCR的羊絨、牦牛絨混合物定量檢測(cè)方法

費(fèi)靜 孫世元 王濤 魏曉英 張回飛

摘 要：物種相近、理化性質(zhì)相同的特種動(dòng)物纖維在外觀形態(tài)上十分相似，難以鑒別，常見(jiàn)的有羊絨/羊毛，駝絨/羊駝絨等。然而，羊絨中的紫羊絨，與細(xì)度相近的牦牛絨混合在一起，更難辨別，是檢測(cè)中的難點(diǎn)，也是目前市場(chǎng)摻假的主要原因。目前，特種動(dòng)物纖維的檢測(cè)主要借助顯微鏡或者電鏡觀察形態(tài)而鑒別，依賴檢驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行判斷，主觀性較強(qiáng)。本研究從毛發(fā)自帶的物種特異性的DNA出發(fā)，借助熒光定量PCR技術(shù)，建立羊絨和牦牛絨的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)這兩種混合物的定量檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：羊絨;牦牛絨;熒光定量PCR;DNA定量檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào)：TS137

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1009-265X（2019）05-0034-05

Abstract：It is hard to identify the fibers of some special animals with close relation in species， physical and chemical properties due to the similar appearance， such as cashmere/wool and camel hair/alpaca fiber. It is even difficulty to identify purple cashmere when it is mixed with yakwool which owns the similar diameter. This is also the main reason of adulteration in the market. Nowadays， special animal fibers are mainly identified by microscopic or SEM examination according to their fiber appearances， which is limited and subjectively by experience of detection personnel. This research focused on species-specific DNA extracted from animal hair， and a quantitation standard curve for cashmere and yakwool was established with the help of fluorescent quantitative PCR technology to achieve quantitative detection of the mixture of the two.

Key words：cashmere; yakwool; fluorescent quantitative PCR; DNA quantitative detection

隨著人們對(duì)綠色生活方式的倡導(dǎo)，傳統(tǒng)的特種動(dòng)物纖維產(chǎn)業(yè)又蓬勃發(fā)展起來(lái)。羊毛、羊絨、駝絨、牦牛絨纖維等均為秋冬季最受歡迎的保暖紡織材料。

羊絨產(chǎn)自山羊，是山羊外表皮特有的一層薄薄地掩在粗毛根部的細(xì)絨，僅占動(dòng)物纖維總產(chǎn)量的0.2%，羊絨以纖細(xì)、滑糯，并兼以柔軟、保暖等特點(diǎn)著稱，被稱為纖維界的“鉆石”、“軟黃金”，稀缺性和珍貴性導(dǎo)致了羊絨的價(jià)格高高在上，遠(yuǎn)高于一般的羊毛產(chǎn)品。中國(guó)是最大的羊絨輸出國(guó)，產(chǎn)量約占全世界產(chǎn)量的四分之三，出口創(chuàng)匯可觀。山羊絨產(chǎn)業(yè)是西部經(jīng)濟(jì)的助推器，也是牧民增收的主要來(lái)源，對(duì)西部經(jīng)濟(jì)有著重要意義。

牦牛是一種能在高原高寒的惡劣環(huán)境下生存的哺乳動(dòng)物，是?？苿?dòng)物唯一有紡織利用價(jià)值的成員。牦牛被稱為高原之舟，生長(zhǎng)于青藏高原及其毗鄰地區(qū)的高寒地帶。牦牛厚厚長(zhǎng)長(zhǎng)的毛層下聚集著細(xì)密的絨毛，這些絨毛為牦牛在高寒的天氣狀況下生存提供了可能。中國(guó)是世界上牦牛數(shù)目最多的國(guó)家，約占全世界總數(shù)的90%。牦牛絨很細(xì)，直徑18～20 μm，長(zhǎng)度為35～50 mm，有不規(guī)則彎曲，鱗片呈環(huán)狀緊密抱合，光澤柔和，彈性強(qiáng)，手感滑糯[1]。

絕大多數(shù)牦牛絨呈棕色。牦牛絨與紫山羊絨在外表形態(tài)上很相似，鱗片的密度、厚度也相近，纖維邊緣整齊，平滑，且兩者在顯微鏡下均存在色素團(tuán)，給鑒別工作帶來(lái)了困難[2]。一些不法分子利用這一相似性，將牦牛絨充作紫山羊絨坑害消費(fèi)者，從中牟利。中國(guó)現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16988—2013《特種動(dòng)物纖維與綿羊毛混合物含量的測(cè)定》對(duì)牦牛絨的描述：牦牛絨纖維鱗片張角較小，鱗片密度為100～130個(gè)/mm，毛色為黑色、棕褐色。而在一般的光學(xué)顯微鏡下，鱗片并不是很清晰，檢測(cè)起來(lái)費(fèi)時(shí)費(fèi)力。電鏡法成本高，且制樣比較煩瑣。由于本身帶有色素，紫山羊和牦牛絨通常會(huì)被制成深色的織物，這就進(jìn)一步給檢測(cè)鑒別工作增加了難度[3-4]。圖1是顯微鏡下的紫山羊絨和牦牛絨。

DNA檢測(cè)近年來(lái)在食品、動(dòng)植物檢疫、司法和環(huán)境監(jiān)測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。熒光定量PCR技術(shù)，是一種加入了熒光基團(tuán)的體外模擬DNA擴(kuò)增的技術(shù)（PCR）。

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，熒光信號(hào)的積累在一定程度上反映了整個(gè)反應(yīng)的進(jìn)度，每增加一條DNA新鏈就能捕捉到一個(gè)熒光分子信號(hào)，同步化了熒光信號(hào)和PCR產(chǎn)物的積累，最后通過(guò)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定性或定量分析[5-6]。

本研究提供了一種基于熒光定量PCR技術(shù)的山羊絨、牦牛絨纖維混合物的定量鑒別方法。針對(duì)山羊、牦牛的線粒體DNA序列設(shè)計(jì)物種特異的引物和探針，利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，建立起山羊絨牦牛絨標(biāo)準(zhǔn)混合物與它們的DNA之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。未知樣品的檢測(cè)可以通過(guò)對(duì)其中山羊源成分、牦牛源成分進(jìn)行定量檢測(cè)，通過(guò)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得各自的含量。

1 試 驗(yàn)

1.1 試驗(yàn)材料

用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的紫山羊絨購(gòu)自內(nèi)蒙古，牦牛絨購(gòu)自專(zhuān)門(mén)生產(chǎn)牦牛絨產(chǎn)品的Shokay公司。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

毛發(fā)抽提、純化試劑盒（Promega公司，貨號(hào)DC6701，DC6740）;2×TaqMan universal master Mix（ABI公司，貨號(hào)4440040）;引物、探針由life science公司合成，具體序列見(jiàn)1.6。

1.3 主要儀器和器具

熒光定量PCR儀（ABI公司，型號(hào)7500）;高速渦旋振蕩儀;冰箱;天平（梅特勒公司，型號(hào)AE240）;液氮冷凍研磨儀（美國(guó)SPEX公司，型號(hào)6870）。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)混合樣和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

使用直徑相近的100%的羊絨、100%的牦牛絨纖維自制標(biāo)準(zhǔn)混合樣。分別稱取羊絨含量為10%，30%，50%，70%，90%，總質(zhì)量為0.5 g山羊絨、牦牛絨混合物。

1.5 DNA提取

把樣品均勻混合，使用液氮冷凍研磨儀或是剪刀粉碎纖維，確保纖維長(zhǎng)度小于0.2 mm。使用Promega DNA IQTM毛發(fā)抽提試劑盒抽提DNA。稱取纖維粉沫10 mg置于1.5 mL離心管中，加入200 μL DTT和150 μL蛋白酶K，56 ℃溫浴震蕩過(guò)夜;第二天加入裂解液700 μL，上下顛倒混合幾次;短時(shí)間離心沉淀未溶解物質(zhì)，吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中，加入7μL 完全懸浮的DNA IQTM樹(shù)脂，高速渦旋振蕩3 s，室溫溫浴10 min;高速渦旋振蕩2 s，將離心管置于磁分離架上，此時(shí)吸附的DNA的磁球緊貼管壁;用移液槍除去含雜質(zhì)的溶液;再加入100 μL裂解液，高速渦旋振蕩2 s，將離心管置于磁分離架上;去除所有的裂解液，加入150 μL洗滌液，高速渦旋振蕩2 s，將管子置于磁分離架上，視情況重復(fù)洗滌2～3次，除盡洗滌液;打開(kāi)管蓋，空氣中干燥5 min;加入70 μL洗脫液，高速渦旋振蕩2 s，65 ℃溫浴5 min;取出離心管，高速渦旋振蕩2 s，置于磁分離架上，小心吸取DNA溶液（整個(gè)過(guò)程可參見(jiàn)Promega DNA IQTM使用說(shuō)明）。

1.6 real-time PCR引物設(shè)計(jì)

收集了NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中山羊、牦牛的線粒體基因序列，重點(diǎn)關(guān)注了DNA（mtDNA）16S rRNA基因，12S rRNA基因，細(xì)胞色素b基因（cytb），控制區(qū)（D-LOOP），ND4基因，挑選了種內(nèi)保守、種間存在差異區(qū)域的12srRNA基因區(qū)域。所設(shè)計(jì)的引物和探針見(jiàn)表1。

1.7 Real-time PCR反應(yīng)體系與擴(kuò)增條件

2×Taqman universal Master Mix 10 μL，10 μmol/L引物各0.8 μL，DNA抽提液4 μL，2 μmol/L探針2.5 μL，H2O 2.7 μL。每個(gè)樣品山羊引物和探針檢測(cè)一次，牦牛引物和探針檢測(cè)一次，每種引物探針3個(gè)復(fù)孔。擴(kuò)增程序：95 ℃，10 min;95 ℃，15 s;60 ℃，30 s，共40個(gè)循環(huán)。使用ABI 7500熒光定量PCR儀擴(kuò)增。

1.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

使用液氮冷凍研磨儀粉碎標(biāo)準(zhǔn)混合物。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)混合物進(jìn)行DNA抽提，每個(gè)混合比例4個(gè)獨(dú)立的樣品。根據(jù)步驟1.7進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。根據(jù)熒光定量PCR的數(shù)學(xué)原理可以推導(dǎo)出，當(dāng)兩個(gè)反應(yīng)的擴(kuò)增效率非常接近時(shí)，羊絨與牦牛的比值的對(duì)數(shù)與兩者對(duì)應(yīng)的Ct值之差存在一定的關(guān)系。

對(duì)儀器采集到的針對(duì)每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)混合物的山羊絨Ct值記為Ctcashmere，牦牛絨Ct值記為Ctyak，求得Ctcashmere-Ctyak兩者的差值ΔCt為橫坐標(biāo)，以log（1/9）、log（3/7）、log（5/5）、log（7/3）、log（9/1）的值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行曲線擬合，建立定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以4個(gè)獨(dú)立批次樣品的羊絨檢測(cè)Ct值與牦牛檢測(cè)Ct值之差的平均值為橫坐標(biāo)，羊絨和牦牛的比值的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)（表2）取點(diǎn)進(jìn)行曲線擬合，得一直線（圖2），且R2>0.99。

對(duì)未知樣品，收提DNA，使用山羊、牦牛引物和探針對(duì)DNA進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可倒推出樣品中羊絨和牦牛的含量。

2.2 幾個(gè)點(diǎn)的驗(yàn)證

使用50%淺棕色、50%深棕色牦牛絨混合物，再與紫山羊絨混合，其中羊絨含量為10%，50%，90%，各取5個(gè)獨(dú)立混合樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如表3。

2.3 方法應(yīng)用

使用該方法對(duì)1個(gè)送檢面料，2個(gè)CCMI（國(guó)際山羊絨駝絨制造商協(xié)會(huì)）的樣品進(jìn)行檢測(cè)。樣品1 客戶申報(bào)為100%山羊絨，樣品2，3為比對(duì)樣品。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

2.4 方法的精密度

通過(guò)5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，對(duì)樣品1（山羊絨10%/牦牛絨90%）;樣品2（50%山羊絨/50%牦牛絨）;樣品3（90%紫山羊絨/10%牦牛絨的混合物）進(jìn)行檢測(cè)，收集數(shù)據(jù)對(duì)方法的精密度進(jìn)行評(píng)估。5個(gè)實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。

對(duì)5個(gè)實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)進(jìn)行柯克倫檢驗(yàn)和格拉布斯檢驗(yàn)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有歧離值或離群值存在。分別對(duì)3個(gè)樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算總平均值m，重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差Sr和再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差SR，從而算得重復(fù)性限r(nóng)和再現(xiàn)性限R，結(jié)果如表6所示。具體計(jì)算公式參考GB/T 6379.2—2004《測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度 第2部分 確定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法》。

對(duì)表6進(jìn)行分析，方法精密度與平均值之間沒(méi)有明顯的依賴關(guān)系。取最R和r作為重復(fù)性和再現(xiàn)性的最終值，重復(fù)性限r(nóng)=3.4%，再現(xiàn)性限R=4.8%。

3 結(jié)論和討論

本研究采用了DNA檢測(cè)手段開(kāi)展了羊絨、牦牛絨混合物的定量檢測(cè)，通過(guò)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立起山羊絨、牦牛絨含量與它們DNA含量之間的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)了山羊絨、牦牛絨定量檢測(cè)。同時(shí)，選擇了3個(gè)水平的含量對(duì)方法的重復(fù)性和再現(xiàn)性進(jìn)行了評(píng)定，分別為3.4%和4.8%。

由于紫羊絨、多數(shù)牦牛纖維均含有色素，歷來(lái)是檢測(cè)的難點(diǎn)。從這兩種纖維的遺傳物質(zhì)入手，實(shí)現(xiàn)了儀器檢測(cè)，可以避免檢測(cè)人員主觀因素的影響。由于色素對(duì)PCR擴(kuò)增有抑制作用，在DNA抽提時(shí)建議使用磁珠試劑盒法，可以有效去除PCR的抑制因素。

DNA檢測(cè)，高質(zhì)量的DNA是基礎(chǔ)。所謂高質(zhì)量的DNA，包含兩層意思，一是DNA的量要達(dá)到熒光定量檢測(cè)反應(yīng)的檢測(cè)低限，另一層是DNA盡量完整，若鏈全部斷裂則無(wú)法檢測(cè)。機(jī)絨處理、后整理中的化學(xué)助劑等均會(huì)對(duì)DNA的完整性造成一定 的影響。而PCR的有效擴(kuò)增，有賴于兩段引物之間的DNA的完整性，將擴(kuò)增序列設(shè)計(jì)在線粒體12srRNA上，且大小在70個(gè)堿基對(duì)左右，可以最大限度地提高有效DNA的利用。

在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，有些企業(yè)會(huì)對(duì)牦牛絨進(jìn)行剝色處理，為的是使之更容易染色，或是能更接近羊絨外觀。遇到這樣的樣品須格外謹(jǐn)慎，如果僅牦牛絨進(jìn)行了氧化剝色處理，是無(wú)法用DNA方法進(jìn)行定量檢測(cè)的，因?yàn)檠趸瘎?huì)對(duì)DNA鏈造成損傷，而兩個(gè)組分的損傷程度不一致，會(huì)使檢測(cè)的牦牛絨含量偏低[6]。當(dāng)牦牛絨與羊絨的損傷程度不一致時(shí)，定量的結(jié)果就會(huì)發(fā)生偏差。反言之，如果兩者進(jìn)行同樣的剝色處理，那損傷程度近似，還是可以利用這個(gè)方法進(jìn)行檢測(cè)。

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