四環(huán)素脅迫對羊角月牙藻生長及抗氧化系統(tǒng)的影響

王雅學(xué) 武鵬鵬 沈洪艷

摘 要：為探究四環(huán)素對藻類產(chǎn)生的毒性效應(yīng)，選擇羊角月牙藻（Selenastrum capricornutum）作為受試生物，采用室內(nèi)試驗(yàn)方法，研究不同質(zhì)量濃度的四環(huán)素（0，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 mg/L）對羊角月牙藻的生長抑制情況、葉綠素a含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量及活性氧（ROS）水平的影響。結(jié)果表明：四環(huán)素對羊角月牙藻的生長具有抑制作用，96 h半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）為3.142 mg/L;四環(huán)素抑制了羊角月牙藻細(xì)胞中的葉綠素a含量;試驗(yàn)96 h時(shí)，隨著四環(huán)素濃度的增大，羊角月牙藻細(xì)胞的SOD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，MDA含量、ROS水平均表現(xiàn)為升高趨勢。因此，四環(huán)素可脅迫羊角月牙藻產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，損害藻體的抗氧化系統(tǒng)，對水生生態(tài)系統(tǒng)具有潛在風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞：環(huán)境毒理學(xué);四環(huán)素;羊角月牙藻;生長抑制;葉綠素a;氧化脅迫

中圖分類號：X171.5 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? doi：10.7535/hbkd.2019yx06013

Abstract：In order to study the toxic effects of tetracycline on algae， Selenastrum capricornutum is selected as the test organism. The growing situation， chlorophyll a contents， superoxide dismutase （SOD） activity， malondialdehyde （MDA） content and reactive oxygen species （ROS） level in the cells of Selenastrum capricornutum after 0， 0.2， 0.4， 0.8， 1.6， 3.2 mg·L-1 tetracycline exposured are studied by indoor test method. The results show that the tetracycline can strongly inhibit growth of Selenastrum capricornutum and the 50% effective concentration （EC50） is 3.142 mg·L-1 during 96 h exposured. Tetracycline treatment inhibits the content of chlorophyll a in the cells of Selenastrum capricornutum. During 96 h exposure period， with the increase of tetracycline concentrations， the activity of SOD shows a "Bell-shaped" trend， the content of MDA and the level of ROS shows an upward trend. The study indicates that tetracycline can cause oxidative stress and damage the antioxidant system in Selenastrum capricornutum cells. Tetracycline poses a potential risk to aquatic ecosystems.

Keywords：environmental toxicology; tetracycline; Selenastrum capricornutum; growth inhibition; chlorophyll a; oxidative stress

四環(huán)素類抗生素是世界上應(yīng)用最為廣泛的抗生素之一[1]，中國是四環(huán)素類抗生素的生產(chǎn)及使用大國[2]，而四環(huán)素（tetracycline）是四環(huán)素類抗生素中的典型藥物，因其抗菌譜廣、質(zhì)優(yōu)價(jià)廉常被作為動(dòng)物飼料添加劑，廣泛應(yīng)用于畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域[3]。研究表明，動(dòng)物所攝入的抗生素中有30%～90%不能被其完全吸收，而是隨尿液和糞便一起排至環(huán)境中[4]。四環(huán)素水溶性較好，易通過各種環(huán)境介質(zhì)轉(zhuǎn)移到地表水、地下水中[5]。那廣水等[6]采集了中國北方13個(gè)市政排污口及相關(guān)河流水樣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在近岸污水排放中四環(huán)素類抗生素的質(zhì)量濃度可達(dá)1.114 μg/L。有研究顯示，黃浦江中四環(huán)素類抗生素的質(zhì)量濃度為0.44～2.69 μg/L[7]。部分地區(qū)的地下水也已經(jīng)檢測到四環(huán)素的存在，質(zhì)量濃度達(dá)到0.003 6 μg/L[8]。四環(huán)素化學(xué)結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，大部分可在環(huán)境中存留1年以上[9]，對生態(tài)環(huán)境的影響不容忽視。姜蕾等[10]研究發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素暴露能夠阻礙銅綠微囊藻的光合作用，破壞抗氧化酶的系統(tǒng)平衡，抑制藻類生物量的增長。周旭東[11]研究后認(rèn)為，四環(huán)素類抗生素主要通過破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)來抑制藻類生長。李捷[12]研究表明，四環(huán)素作用下萊茵衣藻內(nèi)的抗氧化酶活性被激發(fā)。藻類是水生生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)重要的初級生產(chǎn)者，四環(huán)素可能通過食物鏈由低營養(yǎng)級向高營養(yǎng)級富集，進(jìn)而影響整個(gè)水生生態(tài)系統(tǒng)，最終危害人類健康，因此，有必要進(jìn)一步探討四環(huán)素對藻類的效應(yīng)濃度及其生態(tài)毒性。

羊角月牙藻（Selenastrum capricornutum）是一種淡水綠藻，易于分離培養(yǎng)且繁殖周期較短，對毒性物質(zhì)較為敏感[13]，可被作為生物毒性模式生物[14-15]，也是生態(tài)環(huán)境部藻類毒性測試中的推薦藻種之一[16]。因此，本研究以四環(huán)素作為研究對象，以羊角月牙藻作為受試生物，通過測定四環(huán)素暴露下羊角月牙藻細(xì)胞的生長抑制情況、葉綠素a含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、活性氧（ROS）水平的變化，探究四環(huán)素對羊角月牙藻的毒性效應(yīng)，以期為四環(huán)素的安全合理使用、污染治理及相關(guān)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊角月牙藻（FACHB-271）購自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫，在無菌條件下，將藻種重懸于BG11培養(yǎng)基中，置于錐形瓶中在人工氣候培養(yǎng)箱（PRX-250B，寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司提供）內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度為12 000 lux，光照周期為14 h光照+10 h黑暗，每日定期搖晃錐形瓶3次，每次5 min，同時(shí)隨機(jī)調(diào)整錐形瓶位置以使藻細(xì)胞受光均勻，選取對數(shù)生長期的羊角月牙藻細(xì)胞進(jìn)行四環(huán)素毒性效應(yīng)研究。四環(huán)素（分析純）購自上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 染毒試驗(yàn)

將對數(shù)生長期的羊角月牙藻細(xì)胞離心收集（3 500 r/min，4 ℃，10 min），去除上清液，用無菌超純水清洗3次，將收集到的藻細(xì)胞接種至培養(yǎng)基中，加入一定量的四環(huán)素溶液。通過預(yù)試驗(yàn)探明四環(huán)素對羊角月牙藻生長的有效濃度影響范圍。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)置四環(huán)素質(zhì)量濃度梯度分別為0（空白對照），0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 mg/L，并同時(shí)進(jìn)行3個(gè)平行組。在試驗(yàn)開始后的第24，48，72，96 h取樣，進(jìn)行其他測定工作。

1.3 藻細(xì)胞生長測定

在試驗(yàn)開始后第24，48，72，96 h分別取樣，并于顯微鏡下觀察藻類生長狀況，使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定藻細(xì)胞的密度;同時(shí)用紫外分光光度計(jì)測定藻細(xì)胞在波長為684 nm下的吸光度，以建立藻細(xì)胞密度與OD684之間的線性關(guān)系。

1.4 葉綠素a含量的測定

葉綠素a含量的測定采用分光光度法，取5 mL藻液，離心收集（8 000 r/min，10 min）后，棄去上清液，將藻細(xì)胞重懸于體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇中，75 ℃水浴3 min，再次離心（8 000 r/min，10 min）后，用紫外分光光度計(jì)測定上清液在波長665 nm和649 nm下的吸光度[17]。葉綠素a含量計(jì)算公式為Ca=13.95 A665-6.88 A649，式中，Ca為葉綠素a的濃度;A665和A649為葉綠素溶液在波長665 nm和649 nm下的吸光度。

1.5 酶活性的測定

取20 mL藻液，離心收集（6 500 r/min，10 min）后，棄去上清液，使用預(yù)冷的PBS緩沖溶液清洗3次，重懸于PBS緩沖溶液中，使用超聲波細(xì)胞破碎儀冰浴破碎10 min，離心（10 000 r/min，4 ℃，10 min）后取上清液于冰中儲存待測。超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量均采用南京建成工程研究所的檢測試劑盒測定。

1.6 活性氧（ROS）水平的測定

采用SHEN等[18]提出的化學(xué)熒光法測定ROS水平。將DCFH-DA試劑用培養(yǎng)基以1∶1 000進(jìn)行稀釋，使其工作濃度為10 mmol/L。取1 mL藻液，離心（3 500 r/min，15 min）后，用PBS緩沖溶液清洗3次，使用500 μL稀釋后的DCFH-DA試劑重懸，將重懸后的藻細(xì)胞放入人工氣候培養(yǎng)箱中孵育50 min，孵育完成后離心（7 100 r/min，15 min），并用BG11基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗3次，重懸于1 mL培養(yǎng)基中，取200 μL置于96孔板，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，使用多功能酶標(biāo)儀在激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長525 nm下進(jìn)行測定。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one way ANOVA），并用Tukeys作組間多重比較。試驗(yàn)中所有圖表均使用軟件Origin 8.6繪制，其中：*代表p<0.05，**代表p<0.01，均表示差異顯著;***代表p<0.001，表示差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 四環(huán)素對羊角月牙藻生長的影響

根據(jù)藻細(xì)胞密度與OD684的測定結(jié)果，建立二者之間的線性關(guān)系為y=4.627 4x+0.964，R2=0.997 4，該線性回歸模型擬合優(yōu)度較高，可信性較好。觀察試驗(yàn)開始后24，48，72，96 h時(shí)，不同濃度四環(huán)素對羊角月牙藻細(xì)胞密度的影響如圖1所示。由圖1可以看出，48 h后中高濃度四環(huán)素（≥ 0.8 mg/L）脅迫下的藻細(xì)胞生長呈現(xiàn)一定的抑制狀態(tài);96 h時(shí)，與對照組相比，0.2 mg/L試驗(yàn)組的藻細(xì)胞生長被顯著性抑制（p<0.05），其余試驗(yàn)組的藻細(xì)胞生長均被極顯著性抑制（p<0.001），其中羊角月牙藻在3.2 mg/L四環(huán)素的作用下，96 h生長抑制率達(dá)到50.8%。試驗(yàn)結(jié)果表明，四環(huán)素對羊角月牙藻的生長繁殖具有抑制作用。隨著四環(huán)素濃度的升高和試驗(yàn)時(shí)間的延長，羊角月牙藻的細(xì)胞密度逐漸減小，四環(huán)素對羊角月牙藻的抑制效應(yīng)也越明顯，呈現(xiàn)一定的“濃度-效應(yīng)”及“時(shí)間-效應(yīng)”關(guān)系。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，由SPSS軟件計(jì)算可知，96 h時(shí)四環(huán)素對羊角月牙藻的半數(shù)效應(yīng)質(zhì)量濃度（96 h-EC50）及抑制效應(yīng)為80%時(shí)的四環(huán)素質(zhì)量濃度（96 h-EC80）分別為3.142 mg/L和6.309 mg/L。徐冬梅等[19]在四環(huán)素對淡水綠藻的毒性研究中發(fā)現(xiàn)四環(huán)素對蛋白核小球藻的96 h-EC50值及96 h-EC80值分別為6.86 mg/L和17.78 mg/L;對斜生柵藻的96 h-EC50值及96 h-EC80值分別為3.27 mg/L和12.87 mg/L。周旭東[11]研究了四環(huán)素對銅綠微囊藻、小球衣藻的毒性，得出其96 h-EC50值分別是10.394 mg/L和2.038 mg/L。與以上研究結(jié)論類比可知，四環(huán)素脅迫下，羊角月牙藻的96 h-EC50值及96 h-EC80值均低于蛋白核小球藻及斜生柵藻;羊角月牙藻的96 h-EC50值低于銅綠微囊藻，但高于小球衣藻。羊角月牙藻對四環(huán)素脅迫較為敏感。

2.2 四環(huán)素對羊角月牙藻葉綠素a含量的影響

藻類的生長發(fā)育離不開光合作用，而葉綠素就是光合作用重要的基礎(chǔ)物質(zhì)，故葉綠素含量的變化影響光合作用的速率，進(jìn)而影響藻類的生長狀況[20]。而研究發(fā)現(xiàn)，葉綠素b是由葉綠素a演變而來的[21]，葉綠素a的含量決定了藻體內(nèi)葉綠素的總量，故葉綠素a的合成和轉(zhuǎn)化對藻類的生長至關(guān)重要，所以葉綠素a的含量與藻類生物量有著緊密的聯(lián)系。四環(huán)素對羊角月牙藻葉綠素a含量的影響如圖2所示。由圖2可以看出，與對照組相比，1.6 mg/L試驗(yàn)組的葉綠素a含量在試驗(yàn)24，48，72 h均被顯著性抑制（p<0.01），在試驗(yàn)96 h時(shí)被極顯著性抑制（p<0.001）;3.2 mg/L試驗(yàn)組的葉綠素a含量在試驗(yàn)期間均被極顯著性抑制（p<0.001）。本試驗(yàn)中，在3.2 mg/L四環(huán)素的脅迫下，與對照組相比，羊角月牙藻的葉綠素a含量在試驗(yàn)96 h時(shí)顯著下降27%。四環(huán)素的存在降低了藻類葉綠素a的含量，且隨四環(huán)素濃度的增大，抑制效果更為顯著。張迪等[22]研究表明金霉素會使斜生柵藻細(xì)胞內(nèi)的葉綠體發(fā)生萎縮，影響其正常的生長代謝。段煉等[23]發(fā)現(xiàn)在1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽的脅迫下，斜生柵藻葉綠體的片層結(jié)構(gòu)斷裂，葉綠素含量下降。四環(huán)素脅迫可能導(dǎo)致藻細(xì)胞的葉綠素分子受損，影響藻細(xì)胞的新陳代謝及正常光合作用的進(jìn)程，進(jìn)而危害羊角月牙藻的正常生長繁殖過程。

2.3 四環(huán)素對羊角月牙藻SOD活性的影響

SOD是一種誘導(dǎo)酶類，其活性升高可以消除體內(nèi)的ROS，防止機(jī)體抗氧化損傷[24-25]。不同濃度的四環(huán)素對羊角月牙藻SOD活性的影響如圖3所示。試驗(yàn)24 h時(shí)，與對照組相比，各試驗(yàn)組SOD活性均出現(xiàn)增長，其中1.6，3.2 mg/L試驗(yàn)組的SOD活性被顯著性誘導(dǎo)（p<0.05），說明在試驗(yàn)初期，藻體在較高濃度的四環(huán)素（≥1.6 mg/L）脅迫下產(chǎn)生大量ROS，藻細(xì)胞SOD活性升高以消除體內(nèi)過量的ROS;試驗(yàn)96 h時(shí)，與對照組相比，0.2 mg/L試驗(yàn)組的SOD活性被顯著性誘導(dǎo)（p<0.01），0.4 mg/L試驗(yàn)組的SOD活性被顯著性誘導(dǎo)（p<0.05），而3.2 mg/L試驗(yàn)組的SOD活性被顯著性抑制（p<0.05），羊角月牙藻經(jīng)四環(huán)素暴露96 h后，較低濃度的四環(huán)素（≤0.4 mg/L）試驗(yàn)組中，藻細(xì)胞的SOD活性升高以增強(qiáng)對ROS的清除能力，而高濃度的四環(huán)素（3.2 mg/L）脅迫超出了藻體正常歧化能力，抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，氧化損傷加劇，SOD活性降低。在四環(huán)素脅迫下，羊角月牙藻機(jī)體產(chǎn)生大量ROS，SOD作為抵御機(jī)體氧化損傷首先起作用的酶類，可以在一定程度內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的ROS水平[26]。PAPADIMITRIOU等[27]研究表明，當(dāng)生物體受到輕度逆境脅迫時(shí)，SOD活性往往升高以清除過量的ROS，而當(dāng)脅迫進(jìn)一步加劇，SOD活性常常降低。本試驗(yàn)的SOD活性呈現(xiàn)了與之相同的趨勢：在3.2 mg/L試驗(yàn)組中，SOD活性在試驗(yàn)初期（24 h）被顯著性誘導(dǎo)，末期（96 h）時(shí)被顯著性抑制。

2.4 四環(huán)素對羊角月牙藻MDA含量的影響

研究表明，生物體在轉(zhuǎn)化外源污染物質(zhì)的過程中會導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生[28]，而過量的ROS會與生物膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，生成過氧化產(chǎn)物MDA，而MDA的出現(xiàn)又將進(jìn)一步加劇膜損傷狀況[29]，所以MDA含量可以體現(xiàn)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的程度[30]，同時(shí)可以體現(xiàn)機(jī)體受ROS攻擊的情況。如圖4所示，在試驗(yàn)初期（24 h），與對照組相比，0.8 mg/L試驗(yàn)組的藻細(xì)胞MDA含量被顯著性誘導(dǎo)（p<0.05），1.6 mg/L試驗(yàn)組的藻細(xì)胞MDA含量被極顯著性誘導(dǎo)（p<0.001）;試驗(yàn)48 h時(shí)，3.2 mg/L試驗(yàn)組的MDA含量被極顯著性誘導(dǎo)（p<0.001）至試驗(yàn)期間最大值，其余各試驗(yàn)組的MDA含量均被顯著性誘導(dǎo)（p<0.05），表明四環(huán)素可引起羊角月牙藻的氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生過量的ROS攻擊膜不飽和酸，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使其產(chǎn)物的MDA含量升高;試驗(yàn)72 h時(shí)，與對照組相比，1.6，3.2 mg/L試驗(yàn)組的藻細(xì)胞MDA含量均被顯著性誘導(dǎo)（p<0.05）;試驗(yàn)96 h時(shí)，與對照組相比，除0.2 mg/L試驗(yàn)組外，其他各試驗(yàn)組的MDA含量均被極顯著性誘導(dǎo)（p<0.001），說明四環(huán)素脅迫導(dǎo)致的羊角月牙藻氧化損傷效應(yīng)持續(xù)。高問等[31]在土霉素廢水對斑馬魚肌肉組織MDA含量的影響研究中發(fā)現(xiàn)，暴露15 d時(shí)，與對照組相比，各暴露組的MDA含量被顯著性誘導(dǎo)。沈洪艷等[32]研究發(fā)現(xiàn)，70%試驗(yàn)組的鏈霉素廢水對斑馬魚肌肉組織的MDA含量產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，造成嚴(yán)重的氧化損傷。將本試驗(yàn)結(jié)果與其他指標(biāo)對比可知，羊角月牙藻的MDA含量對四環(huán)素脅迫較為敏感。試驗(yàn)96 h時(shí)，不同濃度四環(huán)素脅迫下的羊角月牙藻細(xì)胞內(nèi)的MDA含量隨四環(huán)素濃度的增大呈現(xiàn)升高趨勢，該結(jié)果與劉偉杰等[33]在壬基酚對羊角月牙藻MDA含量影響的研究結(jié)果類似：壬基酚濃度越高，羊角月牙藻的細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度越嚴(yán)重。

2.5 四環(huán)素對羊角月牙藻ROS水平的影響

活性氧（ROS）是細(xì)胞在有氧條件下進(jìn)行能量代謝產(chǎn)生的一類具有氧化活性的分子總稱[34-35]。正常條件下，機(jī)體中產(chǎn)生的ROS可通過抗氧化系統(tǒng)（酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)）的調(diào)節(jié)，穩(wěn)定在動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體受到脅迫時(shí)，ROS過量積累或抗氧化酶的消耗將破壞平衡，引起機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)[36]，如生物膜過氧化、蛋白質(zhì)變性、植物細(xì)胞光合作用受阻、酶的失活等，進(jìn)一步引起氧化損傷[19]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平超過機(jī)體抗氧化能力和修復(fù)水平時(shí)，將誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24]。由圖5所示，與對照組相比，3.2 mg/L試驗(yàn)組的ROS水平在試驗(yàn)48，72，96 h時(shí)均被顯著性誘導(dǎo)（p<0.05）;1.6 mg/L試驗(yàn)組的ROS水平在96 h被顯著性誘導(dǎo)（p<0.05），較高濃度的四環(huán)素（≥1.6 mg/L）在試驗(yàn)48 h后顯著提升了藻細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，表示在較高濃度四環(huán)素（≥1.6 mg/L）的持續(xù)脅迫下，藻細(xì)胞內(nèi)的ROS水平已經(jīng)超出了細(xì)胞自身調(diào)節(jié)及解毒能力，ROS產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)被打破，危害藻體抗氧化系統(tǒng)。

3 結(jié) 論

1）四環(huán)素對羊角月牙藻的生長具有抑制作用，四環(huán)素對羊角月牙藻的96 h-EC50值為3.142 mg/L。

2）四環(huán)素能夠降低羊角月牙藻的葉綠素a含量，抑制羊角月牙藻的光合作用，影響其正常生長進(jìn)程。

3）高濃度四環(huán)素（3.2 mg/L）在試驗(yàn)初期（24 h）對羊角月牙藻細(xì)胞的SOD活性有顯著性誘導(dǎo)作用，末期時(shí)（96 h）呈現(xiàn)顯著性抑制作用。試驗(yàn)期間，四環(huán)素對藻細(xì)胞的MDA含量、ROS水平具有不同程度的誘導(dǎo)作用。試驗(yàn)96 h時(shí)，隨著四環(huán)素濃度的增大，羊角月牙藻細(xì)胞的SOD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢;MDA含量、ROS水平表現(xiàn)為升高趨勢。四環(huán)素脅迫使羊角月牙藻產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，對藻體抗氧化系統(tǒng)造成損傷。

4）四環(huán)素對羊角月牙藻生長及抗氧化系統(tǒng)的影響是個(gè)復(fù)雜的過程，本文選取了生長抑制情況、葉綠素a含量、SOD活性、MDA含量、ROS水平等表征生長和抗氧化的典型指標(biāo)進(jìn)行了測定與分析，今后可進(jìn)一步在毒性作用機(jī)制、基因表達(dá)水平等更深層面進(jìn)行探究。

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