染色體微陣列技術(shù)用于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因診斷中的價值評價

黃紅麗 何文鳳 姜艷華 劉曉瑛 楊小猛

【摘要】 目的：研究染色體微陣列技術(shù)（CMA）應(yīng)用于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因診斷中的價值。方法：抽選2017年7月-2019年6月本院收治的自然流產(chǎn)患者60例進行研究，所有患者均流產(chǎn)2次以上，收集患者的胚胎相關(guān)組織進行CMA檢測，分析檢測結(jié)果，研究CMA應(yīng)用于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診斷中的價值。結(jié)果：所有患者中，染色體數(shù)目異常40例（66.67%），染色體結(jié)構(gòu)異常3例（5.00%），單親二倍體1例（1.67%）;所有患者中，發(fā)生流產(chǎn)最多孕周為8周前，檢出異?；颊咦疃嗟囊矠樵摃r期（82.5%），產(chǎn)婦年齡超過35歲，染色體數(shù)目異常的發(fā)生率更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：使用CMA技術(shù)對產(chǎn)婦的胚胎相關(guān)組織進行染色體檢查，可以發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的危險因素，檢測方法比較簡便高效，對產(chǎn)婦復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的診斷、生育風(fēng)險評估以及生育指導(dǎo)功能具有較大的價值，可以在臨床工作中規(guī)范應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】 復(fù)發(fā)性流產(chǎn) 染色體微陣列分析 染色體異常 遺傳

[Abstract] Objective： To study the value of chromosome microarray technique （CMA） in the diagnosis of recurrent abortion. Method： A total of 60 cases of spontaneous abortion in our hospital from July 2017 to June 2019 were selected for study. All patients had abortion more than twice. The embryo-related tissues of these patients were collected for CMA detection， and the results were analyzed to study the value of CMA in the diagnosis of recurrent abortion. Result： Among all patients， 40 cases （66.67%） had abnormal chromosome number， 3 cases （5.00%） had abnormal chromosome structure and 1 case （1.67%） had single diploid， and the most abnormal patients （82.5%） had abnormal chromosome number before 8 weeks of pregnancy， the maternal age was over 35 years old， and the incidence of abnormal chromosome number was higher， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion： Chromosome examination of embryo-related tissues of parturient using CMA technology can find out the risk factors of recurrent abortion. The method is simple and efficient， has a great value in the diagnosis， reproductive risk assessment and reproductive guidance function of recurrent abortion， and can be standardized in clinical work.

[Key words] Recurrent abortion Chromosome microarray analysis Chromosome abnormalities Inheritance

First-authors address： Shenzhen City Luohu District Maternal and Child Health Hospital， Shenzhen 518000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.30.035

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指同一性伴侶連續(xù)發(fā)生3次及以上的自然流產(chǎn)，其發(fā)生率為1%～3%，但大多數(shù)專家認(rèn)為連續(xù)發(fā)生2次流產(chǎn)即應(yīng)重視并予評估[1-2]。研究與實踐表明，患者發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)次數(shù)越多，不孕、月經(jīng)紊亂以及宮腔粘連等癥狀的發(fā)生率越高，給患者與其家人帶來的悲傷與抑郁等負(fù)性情緒反應(yīng)越大[3]。因此，隨著對該疾病認(rèn)識的加深，相關(guān)醫(yī)務(wù)工作者對流產(chǎn)次數(shù)超過2次以上患者的關(guān)注度逐漸加深，臨床上一般對該類患者進行合理的評估。研究證明，導(dǎo)致自然流產(chǎn)發(fā)生的原因有孕產(chǎn)婦免疫系統(tǒng)功能紊亂、胚胎染色體異常、產(chǎn)婦內(nèi)分泌功能紊亂、生殖系統(tǒng)發(fā)育異常、生殖泌尿系統(tǒng)發(fā)生病原微生物的感染以及宮頸生理功能的紊亂與異常，所有原因中最常見的是胚胎染色體異常[4]。因此，采取科學(xué)規(guī)范的技術(shù)手段對胚胎的染色體進行檢查對檢測與排除復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、指導(dǎo)生育與妊娠具有十分重要的價值[5]。染色體微陣列技術(shù)（CMA）是近幾年研究出的采用微陣列的技術(shù)手段對染色體的數(shù)目形態(tài)等進行分析的技術(shù)[6-7]，該技術(shù)可以實現(xiàn)對全基因組的檢測與掃描，能夠檢測出變異程度極小的微重復(fù)與微缺失，填補了以往常規(guī)檢測手段無法檢測5 Mb以下基因變異的技術(shù)空白，同時該技術(shù)操作簡便，取材方便，對產(chǎn)婦的傷害較小，誘發(fā)感染的可能性比較低[8-9]，因此研究將該技術(shù)應(yīng)用于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)產(chǎn)婦染色體檢測中有一定的意義。為了研究該技術(shù)應(yīng)用于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診斷中的可行性與實際價值，本院特選擇收治的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者進行此次研究，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年7月-2019年6月本院收治的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者60例進行研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）流產(chǎn)次數(shù)≥2次;（2）年齡在20周歲以上;（3）均符合復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的診斷標(biāo)準(zhǔn);（4）診斷確認(rèn)胚胎已經(jīng)停止發(fā)育，并經(jīng)合理評估認(rèn)定需要施行清宮術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并精神疾病;（2）合并糖尿病、高血壓、冠心病等心腦血管疾病;（3）中途退出。60例患者，年齡29～41歲，平均（28.28±1.39）歲;孕周5.33～12.00周，平均（8.46±1.08）周;流產(chǎn)次數(shù)2～5次，平均（2.43±1.07）歲。該研究已經(jīng)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 材料、試劑與儀器 （1）材料。DNA提取盒（德國Qiagen公司生產(chǎn)），PCR純化試劑盒、基因工程相關(guān)酶類（Nsp I、T4連接酶等）、PCR擴增試劑盒（美國Clontech公司生產(chǎn)）、標(biāo)記與片段化試劑盒、芯片試劑盒（美國Affymetrix公司生產(chǎn)）。（2）設(shè)備。雜交儀、洗滌工作站、掃描儀，均來自美國Affymetrix公司。

1.3 方法 手術(shù)前，預(yù)先將需要進行樣本采集的1.5 mL離心管裝入適量生理鹽水，在對產(chǎn)婦進行手術(shù)過程中，將手術(shù)獲取的胚胎部位組織用無菌生理鹽水沖洗干凈，然后使用干凈未受污染的手術(shù)器械將胚胎的絨毛組織剪下大約80 mg，將剪取的組織放置在事先準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，盡快（不超過1 h）送到實驗室進行檢測。送入實驗室后使用專業(yè)的DNA提取試劑盒對組織中的全基因組DNA進行提取，提取完成后，將提取到的DNA取250 ng，使用Nsp I酶進行處理，將其分解為較小的片段，然后把分解產(chǎn)物的尾端補齊，再使用T4連接酶將共同引物連接于分解的片段上，然后將該片段進行PCR擴增以及純化處理，最后使用標(biāo)記與片段化試劑盒進行處理，將其同雜交液混勻，經(jīng)過變性處理后置于芯片試劑盒，然后使用雜交儀雜交16 h左右，注意轉(zhuǎn)速控制在60 r/min，溫度為50 ℃，最后雜交后的樣品使用洗滌工作站進行處理，將染色洗凈，使用掃描儀進行圖像的捕獲，取得本研究需要的數(shù)據(jù)。

1.4 結(jié)果判讀 本研究經(jīng)過CMA取得的實驗數(shù)據(jù)使用專業(yè)數(shù)據(jù)分析軟件進行分析。然后對拷貝數(shù)變異（CNV）情況進行分析比較，比較的標(biāo)準(zhǔn)來自DGV、OMIM、DECIPHER以及ISCA等數(shù)據(jù)庫，同時結(jié)合查閱的相關(guān)專業(yè)文獻(xiàn)資料，嚴(yán)格解讀患者的CNV情況，現(xiàn)階段的研究認(rèn)為，CNV可以分成3個不同的等級：（1）致病性;（2）未確定意義;（3）不致病。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 24.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗與Fisher檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 染色體異常的類型與分布情況 所有患者中異常44例（73.33%），其中染色體數(shù)目異常40例（66.67%），染色體結(jié)構(gòu)異常3例（5.00%），單親二倍體1例（1.67%），見表1。

2.2 異?；颊咴兄芊植记闆r 所有患者中，發(fā)生流產(chǎn)最多孕周為8周之前，檢出異?；颊咦疃嗟囊矠樵摃r期（82.5%），見表2。

2.3 患者染色體異常的年齡分布 產(chǎn)婦年齡超過35歲，染色體數(shù)目異常的發(fā)生率更高，差異有統(tǒng)計學(xué)有意義（P<0.05），見表3。

3 討論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)指的是連續(xù)發(fā)生2次及以上的自然流產(chǎn)，產(chǎn)婦大多在妊娠的20周以內(nèi)發(fā)生流產(chǎn)，妊娠終止，發(fā)生該病之前最常見的癥狀有異常陰道出血以及腹部疼痛。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，該病與多種因素有關(guān)，比較常見的有產(chǎn)婦生殖系統(tǒng)發(fā)育異常、胎兒染色體異常以及遭受病原微生物的感染等，其中最常見的致病因素是胎兒發(fā)生的染色體異常[10-11]。臨床上診斷和治療該疾病時需要通過規(guī)范的體格檢查、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)纳笜?biāo)以及相關(guān)影像學(xué)手段等將該病與異位妊娠、葡萄胎等疾病進行鑒別診斷，同時明確發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的具體病因并做出合理干預(yù)指導(dǎo)。因此，采取適當(dāng)?shù)氖侄蚊鞔_產(chǎn)婦發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因具有重要的現(xiàn)實意義。但是以往檢測手段復(fù)雜多樣，缺乏針對性，同時許多檢查手段對患者傷害較大，難以被患者接受，因而限制了該病的診斷與治療。本院考慮采用CMA技術(shù)對流產(chǎn)胎兒進行染色體檢查，評估該項檢查應(yīng)用的實際價值。

CMA技術(shù)是一項遺傳學(xué)檢查技術(shù)，該技術(shù)可以實現(xiàn)對整體基因組拷貝數(shù)的單次、高通量、高敏感性以及高分辨率的檢測[12-13]，能夠?qū)Πl(fā)生變異的位置以及內(nèi)在實際基因含量進行精確地定位，同時通過與正常基因組進行比對分析，可以對患者的相關(guān)臨床癥狀做出合理解釋，對患者的治療方案以及疾病治療的預(yù)后做出科學(xué)評估[14]。因此CMA技術(shù)與其他的遺傳學(xué)檢查技術(shù)相比，對染色體異常的檢出更精確靈敏[15]，對因染色體異常導(dǎo)致的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的臨床診斷具有較大的價值，除此之外，還可以對夫妻雙方的變異位點進行檢測，實現(xiàn)對下一次生育的流產(chǎn)風(fēng)險評估，效果卓著，具有其他研究方法不具有的優(yōu)點。

本研究中，所有患者檢測均成功，共檢測出染色體存在異?；颊?4例（73.33%），其中染色體數(shù)目異常者有40例（66.67%），染色體結(jié)構(gòu)異常3例（5.00%），單親二倍體者有1例（1.67%）。本結(jié)果可以證明，染色體異常是引起復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的最常見原因。所有染色體數(shù)目異常患者中，最常見的異常類型是16三體，其次常見的X染色體缺失，另外21三體異常現(xiàn)象的出現(xiàn)比例也比較高，其余異常類型相對而言出現(xiàn)比例較低，這提示在臨床工作中要注意以上常見異常類型的排查，如果在患者的流產(chǎn)胚胎中查見非整倍異?，F(xiàn)象，那么可以認(rèn)為導(dǎo)致產(chǎn)婦發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的最根本原因是非整倍體異常。針對此現(xiàn)象，建議患者按照科學(xué)合理的方式進行自然妊娠，妊娠期間注意做好相關(guān)檢查與篩查工作，發(fā)現(xiàn)異常時及時處置。比較孕周與流產(chǎn)之間關(guān)系發(fā)現(xiàn)，所有患者中，發(fā)生流產(chǎn)最多孕周為8周之前，檢出異?；颊咦疃嗟囊矠樵摃r期（82.50%），這可能是因為染色體異常在妊娠早期即可導(dǎo)致胚胎停止發(fā)育，引起流產(chǎn)，這提示要做好早期妊娠的排查工作，對存在明確流產(chǎn)跡象的產(chǎn)婦按照診療規(guī)范做出處理。最后，還分析了產(chǎn)婦年齡與染色體異常之間的關(guān)系，結(jié)果表明，產(chǎn)婦年齡超過35歲以后，染色體數(shù)目異常的發(fā)生率更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。因此，要指導(dǎo)備孕夫妻盡量在合適的年齡妊娠，同時加強對高齡產(chǎn)婦的監(jiān)測，做好針對此類產(chǎn)婦的臨床檢查工作，及時排查染色體異?，F(xiàn)象。

綜上所述，將CMA檢查技術(shù)應(yīng)用于自然流產(chǎn)患者的臨床診斷中，對該類患者胚胎相關(guān)組織進行染色體分析，準(zhǔn)確率較高，分辨率較高，可以檢出拷貝數(shù)很小的變異基因;同時，此種技術(shù)操作簡單，取材方便，可以提取產(chǎn)婦流產(chǎn)的絨毛組織以及死亡的胚胎相關(guān)組織進行檢測，對產(chǎn)婦傷害較小，易于被產(chǎn)婦及家人接受。同時在檢測時不需要進行培養(yǎng)操作，縮短了等待時間，克服了常規(guī)檢測手段等待時間長、對患者傷害較大、檢測準(zhǔn)確率低等缺點，效果顯著，減輕了患者受到的傷害，利于排查產(chǎn)婦流產(chǎn)的原因，利于對妊娠進行指導(dǎo)，具有較高的臨床應(yīng)用價值，前景廣闊，值得推廣。

參考文獻(xiàn)

[1]染色體微陣列分析技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用協(xié)作組.染色體微陣列分析技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用專家共識[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2014，49（8）：570-572.

[2]滕奔琦，范建輝，章鈞，等.初次自然流產(chǎn)與復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)絨毛組織細(xì)胞遺傳學(xué)分析[J].新醫(yī)學(xué)，2011，42（11）：723-726.

[3]陳玉清，裴慧慧，姚書忠，等.不孕癥女性患者焦慮抑郁狀況及相關(guān)因素分析[J].新醫(yī)學(xué)，2013，44（11）：756-760.

[4]季修慶，李璃，林穎，等.應(yīng)用單核首酸多態(tài)性一微陣列比較基因組雜交技術(shù)檢測胎兒標(biāo)記染色體[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2012，29（5）：510-514.

[5]熊佳麗，王晶，董一善，等.染色體微陣列技術(shù)在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因診斷中的應(yīng)用[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2018，28（31）：37-41.

[6]程丹，楊箐，李潔，等.復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)胎兒絨毛染色體微陣列芯片327例分析[J].新醫(yī)學(xué)，2018，49（11）：787-792.

[7]宋婷婷，萬陜寧，黎早，等.染色體微陣列分析技術(shù)在側(cè)腦室增寬胎兒產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價值[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2017，42（10）：902-908.

[8]胡婷，張竹，王嘉敏，等.染色體微陣列分析在染色體核型分析無法明確診斷病例中的應(yīng)用價值[J].四川大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2017，48（3）：460-463.

[9]張燕，符芳，李茹，等.全基因組高分辨率染色體微陣列分析在超聲結(jié)構(gòu)異常胎兒中的應(yīng)用[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2015，32（2）：169-174.

[10]羅彩群，劉洋，鄧惠敏，等.染色體微陣列分析技術(shù)在血清學(xué)篩查高風(fēng)險孕婦中的應(yīng)用價值分析[J/OL].臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志，2019，6（29）：127-128.

[11]章鴦，戴美珍，劉佳媚，等.染色體微陣列分析技術(shù)在單臍動脈胎兒中的應(yīng)用[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2019，27（3）：342-343，291.

[12] Vogel I，Petersen O B，Christensen R，et al.Chromosomal microarray as primary diagnostic genomic tool for pregnancies at increased risk within a population-based combined first-trimester screening program[J].Ultrasound Obstet Gyneco1，2018，51（4）：480-486.

[13]American College of Obstetricians and Gynecologists Committee on Practice Bulletins-Obstetrics，Committee on Genetics，Society for Maternal-Fetal Medicine.Practice Bulletin No.162：Prenatal Diagnostic Testing for Genetic Disorders[J].Obstet Gynecol，2016，127（5）：108-122.

[14] Wright D，Carey L，Battersby S，et al.Validation of a Chromosomal Microarray for Prenatal Diagnosis Using a Prospective Cohort of Pregnancies with increased hick for Chromosome Abnormalities[J].Genet Test Mol Biomarkers，2016，20（12）：791-798.

[15] Baker J，Shuman C，Chitayat D，et al.Informed Decision-Making in the Context of Prenatal Chromosomal Microarray[J].J Genet Couns，2018，27（5）：1130-1147.

（收稿日期：2019-08-02） （本文編輯：程旭然）