臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠脊髓損傷區(qū)域神經(jīng)損傷的修復(fù)效果分析

吳玲玲 潘曉明 陳浩浩 傅曉艷 王文倩 江文嬌 張輝 丁明星

【摘要】 目的：探究臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UMSCs）移植對大鼠脊髓損傷區(qū)域神經(jīng)損傷的修復(fù)效果。方法：選擇70只大鼠，雄性，體重220～260 g，采用隨機(jī)數(shù)字法分為研究組和對照組，各35只。兩組大鼠均采用脊髓半切建模。建模1周后研究組行UMSCs移植，對照組給予等量不含干細(xì)胞0.9%氯化鈉溶液注射。移植24 h及1、2、4周后，比較兩組Tarlov評分。移植2周后，觀察兩組的組織學(xué)情況，比較兩組血清白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平。結(jié)果：移植24 h后兩組Tarlov評分均較低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），移植1、2、4周后研究組Tarlov評分均明顯高于對照組（P<0.05）。移植2周后，對照組大鼠脊髓組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，脊髓空洞面積大，神經(jīng)纖維相對稀疏，存在不同程度的炎性細(xì)胞浸潤且星型膠質(zhì)細(xì)胞明顯聚集增生;研究組炎性細(xì)胞浸潤且星型膠質(zhì)細(xì)胞與對照組比較明顯降低，且有神經(jīng)纖維通過大鼠脊髓損傷區(qū)域。研究組移植2周后兩組IL-1比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），研究組IL-6和TNF-α水平均明顯低于對照組（P<0.05）。結(jié)論：采用UMSCs在一定程度上可以減輕大鼠損傷脊髓部位的炎性細(xì)胞浸潤、抑制膠質(zhì)細(xì)胞形成瘢痕組織，對于改善大鼠神經(jīng)損傷后功能的恢復(fù)有著重要意義。

【關(guān)鍵詞】 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 移植 脊髓損傷

[Abstract] Objective： To investigate the repair effect of umbilical cord mesenchymal stem cells （UMSCs） transplantation on nerve injury in rats with spinal cord injury. Method： A total of 70 rats were selected， males weight was 220-260 g. They were divided into study group and control group according to the random number table method， 35 rats in each group. Both groups were modeled by spinal cord semisection. One week after modeling， the study group was given UMSCs transplantation and the control group was given equal amount of 0.9% sodium chloride solution injection without stem cells. The Tarlov scores were compared between the two groups 24 h， 1， 2 and 4 weeks after transplantation. Two weeks after transplantation， the histology of the two groups was observed and the serum levels of interleukin-1 （IL-1）， interleukin-6 （IL-6） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） were compared. Result： Tarlov score was lower in both groups 24 h after transplantation， the difference was not statistically significant （P>0.05）. The Tarlov score of the study group was significantly higher than those of the control group after 1， 2 and 4 weeks of transplantation （P<0.05）. Two weeks after transplantation， histological examination of the spinal cord in the control group showed that the area of the spinal cavity was large， the nerve fibers were relatively sparse， there were inflammatory cell infiltration of different degrees， and astrocytes were obviously clustered and proliferated. In the study group， inflammatory cell infiltration and astrocytes were significantly lower than those in the control group， and nerve fibers passed through the spinal cord injury area of the rats. There was no significant difference in IL-1 between the two groups 2 weeks after transplantation （P>0.05）. And IL-6 and TNF-α levels in the study group were significantly lower than those in the control group （P<0.05）.Conclusion： UMSCs can alleviate the inflammatory cell infiltration at the site of spinal cord injury in rats and inhibit the formation of scar tissue in glial cells， which is important to improve the recovery of function after nerve injury in rats.

[Key words] Umbilical cord mesenchymal stem cells Transplantation Spinal cord injury

First-authors address： Medical Molecular Biology Laboratory of Jinhua Polytechnic， Jinhua 321007， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.30.008

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UMSCs）是除了造血干細(xì)胞（hematoporetic stem cell，HSC）以外的另一類具有高度自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞，具有來源豐富，采集方便，供者無痛苦，移植后急性移植物抗宿主病發(fā)生率低等特點(diǎn)[1-3]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）損傷后對于其修復(fù)的研究，目前仍是醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)，特別是間質(zhì)干細(xì)胞在機(jī)體神經(jīng)組織損傷后的修復(fù)和再生上有著重要的作用，也引起越來越多的關(guān)注[4-6]。本次研究旨在分析通過在體研究，來進(jìn)一步關(guān)注將臍間充質(zhì)干細(xì)胞移植到脊髓損傷的大鼠后，觀察移植后其存活、分化情況及其神經(jīng)功能的恢復(fù)情況，為臨床上細(xì)胞移植在治療脊髓損傷提供一定的科學(xué)依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇70只大鼠，雄性，體重220～260 g，由浙江省實驗動物中心提供，動物許可證號為SCXK（浙）2014-0001。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為研究組和對照組，各35只，兩組大鼠均給予了脊髓左側(cè)半切，建立脊髓損傷模型。

1.2 方法 移植標(biāo)記及模型建立：本研究所用臍帶組織為健康產(chǎn)婦自愿捐贈，由金華市思丹姆干細(xì)胞生物科技有限公司提供。移植標(biāo)記：對于UMSCs首先在體外進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)融合時，向其加入Brdu（Sigma公司），10 μg/mL，加入后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，在對大鼠進(jìn)行移植前在給予胰蛋白酶（美國Gibco公司）消化，分別經(jīng)離心、洗滌后將其稀釋成為懸液進(jìn)行備用。模型建立：采用戊巴比妥鈉（30 mg/kg）對大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，麻醉后以大鼠的T10為中心，對其進(jìn)行解剖，剝離大鼠脊椎兩側(cè)的椎旁肌，剝離大鼠脊椎椎體的硬膜，暴露T9～11的棘突和椎板，暴露出該階段的脊髓，采用外科顯微鏡將脊髓半切至脊髓后正中靜脈右緣。干細(xì)胞移植：研究組在給予脊髓半切1周后在行UMSCs移植。UMSCs的移植主要采用單細(xì)胞注射器進(jìn)行，將其注射到大鼠脊髓損傷的附近區(qū)域，細(xì)胞數(shù)量不少于1×109個。對照組大鼠建模1周后給予等量不含干細(xì)胞生理鹽水注射。

1.3 觀察指標(biāo)與判定標(biāo)準(zhǔn) （1）比較兩組神經(jīng)功能評分。在移植后24 h和1、2、4周分別進(jìn)行Tarlov評分，分值0～7分，其得分越低，說明功能障礙越嚴(yán)重。（2）組織學(xué)變化觀察，觀察移植2周后兩組經(jīng)再次麻醉取材其T4～L1段脊髓，再行HE染色觀察大鼠損傷區(qū)域恢復(fù)情況。（3）比較兩組炎癥因子水平。移植2周后，采集大鼠靜脈血2～3 mL，將其置于抗凝管內(nèi)，利用酶聯(lián)免疫法檢測血清白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平，以上操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組Tarlov評分比較 移植24 h后兩組Tarlov評分均較低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;移植1、2、4周后研究組Tarlov評分均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 兩組組織學(xué)觀察 移植2周后觀察對照組大鼠脊髓組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，脊髓內(nèi)灰白質(zhì)界限不清，空洞面積大，見空泡樣壞死灶、神經(jīng)纖維相對稀疏、混亂，存在不同程度的炎性細(xì)胞浸潤且星型膠質(zhì)細(xì)胞明顯聚集增生;而研究組大鼠移植2周后其炎性細(xì)胞浸潤且星型膠質(zhì)細(xì)胞與對照組比較明顯降低，且有神經(jīng)纖維通過大鼠脊髓損傷區(qū)域。

2.3 兩組相關(guān)炎性因子比較 移植2周后兩組IL-1比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;研究組IL-6和TNF-α水平明顯均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

以往研究認(rèn)為，CNS中神經(jīng)細(xì)胞一旦發(fā)生損傷后，往往不能再生。但近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步和UMSCs移植這一概念的提出，對于各種干細(xì)胞及其可塑性的相關(guān)研究為干細(xì)胞修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)帶來了希望[7-8]。其主要是由于干細(xì)胞有著很輕的自我更新能力，目前相關(guān)研究證實，利用神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞對其進(jìn)行移植，其在一定程度上可以促進(jìn)神經(jīng)損傷的恢復(fù)。采用UMSCs進(jìn)行移植具有以下優(yōu)點(diǎn)，第一，免疫原性相對較低，發(fā)生免疫排斥的反應(yīng)要低很多，第二，其在獲得上和擴(kuò)增上相對比較容易;第三，其可塑性相對較好，能夠分泌營養(yǎng)因子來調(diào)節(jié)損傷部位的微環(huán)境[9-10]。

目前在臨床上采用細(xì)胞或組織移植進(jìn)行脊髓損傷的治療，已經(jīng)成為主要治療手段之一，這也國內(nèi)外相關(guān)學(xué)者所證實的一樣，UMSCs不僅可以對缺失神經(jīng)組織進(jìn)行填充，其還可以通過分泌營養(yǎng)因子、增加損傷血管增生，減少缺血損傷[11-12]。通過對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、促炎和抗炎細(xì)胞因子的作用，靶向鞘內(nèi)移植可以緩解脊髓損傷后的神經(jīng)病理性痛[13-14]。我國學(xué)者利用未經(jīng)處理的UMSCs將其移植到脊髓半切損傷的大鼠后，發(fā)現(xiàn)其不但能夠長期存活，還具有促進(jìn)軸突再生的作用[15-16]。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其可以促進(jìn)大鼠神經(jīng)纖維的恢復(fù)[17]，本次研究也證實了這一點(diǎn)。目前關(guān)于細(xì)胞移植的相關(guān)實驗眾多，但關(guān)于移植細(xì)胞濃度以及移植時間的研究或文獻(xiàn)缺乏，不同濃度與不同移植時間是否對脊髓損傷的修復(fù)有所影響，還需要進(jìn)一步證實[18]。炎性因子IL-6由淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌，是一種急性期炎癥的重要細(xì)胞因子，具有抗病毒以及促使中性粒細(xì)胞生成和釋放彈性蛋白酶的作用[19-21]。本研究結(jié)果顯示，研究組IL-6、TNF-α炎性因子水平均明顯低于對照組（P<0.05），這也在一定程度上說明了UMSCs移植不僅對大鼠脊髓損傷區(qū)域神經(jīng)損傷的修復(fù)效果較好，對其降低其體內(nèi)炎性水平也有重要意義。

總之，本次研究認(rèn)為，采用UMSCs移植在一定程度上可以減輕大鼠損傷脊髓部位的炎性細(xì)胞浸潤、抑制膠質(zhì)細(xì)胞形成瘢痕組織，對于改善大鼠神經(jīng)損傷后功能的恢復(fù)有著重要意義。由于本次樣本量相對較少，在下一步探究中還需加大樣本量行進(jìn)一步探究分析。

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（收稿日期：2019-08-12） （本文編輯：田婧）