殼聚糖與大蒜素聯(lián)用抑菌與伽師瓜抗菌貯藏研究

張強(qiáng)，王丹，李冠*

1(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆 烏魯木齊, 830046) 2(新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆 石河子， 832000)

甜瓜(CucumismeloL.)，1年生的草本葫蘆科植物，伽師瓜是提昂的一個(gè)厚皮品種，因原產(chǎn)地為新疆伽師縣而得名。伽師瓜汁多肉脆、香甜可口，深受人們青睞。然而，伽師瓜容易染病腐爛，難以長(zhǎng)期貯藏保鮮[1]。目前，使用化學(xué)藥物是控制甜瓜染病腐爛的主要方法，但藥物殘留存在食品安全隱患。因此，研究開(kāi)發(fā)安全、高效的天然抗菌劑，對(duì)減少甜瓜貯藏過(guò)程中病害腐爛、延長(zhǎng)保鮮期、減少化學(xué)藥劑使用量、提高食品安全都有重要意義。

殼聚糖與大蒜素均為天然產(chǎn)物，安全無(wú)毒。殼聚糖是甲殼質(zhì)脫乙酰后的產(chǎn)品，有一定的抑菌活性[2]，殼聚糖分子量從幾千至幾十萬(wàn)，研究表明，黏均分子量在1.5×105左右的殼聚糖有較強(qiáng)的抑菌活性[3-4]；殼聚糖還具有成膜特性[5]，目前殼聚糖已應(yīng)用于抑菌保鮮膜[6]，曹雪慧等用殼聚糖涂膜對(duì)果蔬保鮮的研究表明，殼聚糖在發(fā)揮抑菌作用的同時(shí)，果蔬水分的散失亦得到減緩[7]，殼聚糖與其他物質(zhì)結(jié)合使用，保鮮效果更好，李慧妍將殼聚糖與1-甲基環(huán)丙烯復(fù)配，既有抑菌效果，還能減緩果蔬的呼吸作用[8]，殼聚糖與ZnO混合能夠增加膜強(qiáng)度與抑菌活性[9]，黃皮精油-殼聚糖復(fù)合涂膜番木瓜能顯著降低瓜病情指數(shù)，延緩果實(shí)腐爛[10]。大蒜素是廣譜抑菌劑，其抑菌活性很強(qiáng)[11]，姜紹通等在冷卻肉表面涂抹大蒜素，抑菌效果顯著，冷卻肉的保鮮期可達(dá)19d以上[12]；王梅等用大蒜素提取液對(duì)鮮切山藥進(jìn)行保鮮，結(jié)果顯示大蒜素能夠殺菌防腐爛，并能抑制多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶的酶活性，降低鮮切山藥的呼吸強(qiáng)度與褐變度，減少鮮切山藥的失重[13]。雖然大蒜素抗菌保鮮性能優(yōu)良，但氣味不佳，多用于須烹煮后熟食的肉類或蔬菜。而瓜類多有較厚的皮，如西瓜，甜瓜，大蒜素難以對(duì)瓜內(nèi)的食用部分的風(fēng)味產(chǎn)生影響。目前，將殼聚糖與大蒜素聯(lián)合使用，聯(lián)合抑菌劑的活性與穩(wěn)定性以及對(duì)甜瓜的抗菌保鮮作用尚不明確。因此，本文以殼聚糖、大蒜素為抑菌劑，對(duì)厚皮甜瓜品種伽師瓜貯藏過(guò)程中常見(jiàn)的4種致腐爛病原菌[14-15]：毛霉菌(Mucormucdo)、鐮飽菌(Fusariumspp.)、鏈格孢菌(Alternariaalternata)、青霉菌(Penicillumspp.)的抑菌活性進(jìn)行了研究，并將2種抑菌劑聯(lián)合使用，研究聯(lián)合抑菌劑在伽師瓜貯藏過(guò)程的抗菌防腐爛作用，為甜瓜抗菌貯藏保鮮提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

殼聚糖，脫乙酰度96%，黏均分子量為1.5×105，購(gòu)于上海紫一試劑廠；大蒜素制品，大蒜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，購(gòu)于華牧康藥業(yè)；供試菌種：毛霉菌、鐮飽菌、鏈格孢菌、青霉菌，購(gòu)于上海桑戈生物科技有限公司；伽師品種甜瓜，由新疆大學(xué)生物工程研究中心提供。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY-200B型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；DHP-9162型恒溫培養(yǎng)箱，上海印溪儀器儀表有限公司；721G-100型分光光度計(jì)，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；KK25F55TI型冰箱，三洋電器股份有限公司；LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 抑菌溶液制備

殼聚糖抑菌溶液制備：將分子量為1.5×105殼聚糖，用20 g/L醋酸溶液溶解達(dá)到飽和后，用無(wú)菌蒸餾水稀釋至15 g/L，再用0.1 mol/L NaOH將溶液pH值調(diào)節(jié)至6.0[16]；

大蒜素抑菌溶液制備：參照2013年版美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(clinical and laboratory standards institute, CLSI)標(biāo)準(zhǔn)，以無(wú)菌蒸餾水為溶劑配制大蒜素的終濃度為1.435 μg/mL[17-18]。

1.3.2 菌株培養(yǎng)及菌懸液的制備

將菌株接種于(luria-bertani, LB)固體培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)12～36 h，挑選單一菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，于28 ℃、180 r/min培養(yǎng)至菌液OD值達(dá)到0.6。菌懸液的制備：將所培養(yǎng)的菌調(diào)至0.5麥?zhǔn)媳葷釂挝籟19]。

1.3.3 抑菌活性的測(cè)定

最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)的測(cè)定：將待測(cè)菌液用微量二倍稀釋法依次稀釋抑菌劑溶液，再依次加入待測(cè)菌液，以無(wú)菌蒸餾水做陰性對(duì)照，重復(fù)3次，將平板置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果[20]。

抑菌圈直徑的測(cè)定：采用濾紙片擴(kuò)散法，用十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑[20]。

抑菌率的測(cè)定：比濁度法[21]，抑菌率計(jì)算公式如下：

(1)

式中：A600mm，600 nm波長(zhǎng)處吸光度，ΔA600nm，單位時(shí)間內(nèi)A600nm變化。

殼聚糖、大蒜素聯(lián)合抑菌劑的配制及抑菌活性測(cè)定：抑菌劑同時(shí)對(duì)4種病原菌都有抑菌作用，應(yīng)取4種病原菌中MIC值中最大者。殼聚糖組與大蒜素組對(duì)應(yīng)的最大MIC值分別記為C1和C2。分別以C1和C2為2種抑菌物質(zhì)終濃度配制聯(lián)和抑菌劑溶液，測(cè)定聯(lián)合抑菌劑的抑菌活性[22-23]。

1.3.4 聯(lián)合抑菌劑的抑菌穩(wěn)定性測(cè)定[24]

對(duì)聯(lián)合抑菌劑分別做以下處理：

溫度處理，分別用40、50、60、70、80、90 ℃水浴處理聯(lián)合抑菌劑30 min，以20 ℃下抑菌活性作為對(duì)照；

pH值處理，將聯(lián)合抑菌劑溶液分別調(diào)至pH值為3、4、5、6、7、8、9、10；

紫外光照射處理，將聯(lián)合抑菌劑置于20 W的紫外燈下30 cm處分別照射20、40、60、80 min；

對(duì)抑菌劑做以上處理后，分別測(cè)定抑菌劑的抑菌圈直徑與抑菌率，重復(fù)3次，取平均值。

1.3.5 在伽師瓜貯藏過(guò)程中聯(lián)合抑菌劑抗菌防腐爛作用的測(cè)定[25]

聯(lián)合抑菌劑對(duì)4種病原菌的抗菌防腐爛作用測(cè)定：取成熟度一致的伽師瓜樣本，用60 ℃無(wú)菌水燙漂2 min，并紫外光照射10 min，再向瓜表面接入所選4種病原菌。處理組，在接入病原菌的樣本表面噴涂聯(lián)合抑菌劑，對(duì)照組樣本不做抑菌處理，貯藏溫度20 ℃，每10 d統(tǒng)計(jì)1次腐爛率。處理組與對(duì)照組各3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10個(gè)瓜。

聯(lián)合抑菌劑對(duì)樣本自帶與貯藏環(huán)境病原菌的抗菌防腐爛作用測(cè)定：取成熟度一致的伽師瓜，在處理組中，向瓜面均勻噴涂聯(lián)合抑菌劑，對(duì)照組樣本不做抗菌處理，貯藏溫度20 ℃，每10 d統(tǒng)計(jì)1次腐爛率。處理組與對(duì)照組各3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10個(gè)瓜。

腐爛率計(jì)算公式[26]：

(2)

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel統(tǒng)計(jì)和繪圖，用SPSS 17.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行方差分析，以p<0.05作為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖、大蒜素的MIC以及抑菌活性的測(cè)定

如表1所示，殼聚糖與大蒜素對(duì)毛霉菌、鐮飽菌、鏈格孢菌、青霉菌均有抑菌活性，對(duì)這4種病原菌：殼聚糖的MIC分別為3.7、3.1、4.2、5.5 g/L，與MIC對(duì)應(yīng)的抑菌圈直徑分別4.5、5.3、3.5、3.9 mm，抑菌率分別為34.3%、39.5%、29.3%、32.8%；大蒜素的MIC分別為2.3、1.7、2.2、2.6 g/L，與MIC對(duì)應(yīng)的抑菌圈直徑分別12.7、15.5、14.3、14.6 mm，抑菌率分別為59.6%、63.7%、71.3%、67.6%；殼聚糖的MIC均高于大蒜素，而對(duì)應(yīng)的抑菌圈直徑與抑菌率則小于大蒜素(p<0.05)，由此可知，大蒜素對(duì)4種病原菌的抑菌活性均強(qiáng)于殼聚糖。

表1 殼聚糖、大蒜素的MIC、抑菌圈直徑和抑菌率Table 1 The MIC and inhibitory zone diameters and inhibitory rate of chitosan and allicin

2.2 殼聚糖、大蒜素與聯(lián)合抑菌劑的抑菌活性

由2.1結(jié)果所示，在4種病原菌中，殼聚糖對(duì)青霉菌的MIC最大，以此濃度作為殼聚糖的質(zhì)量濃度(ρ1)，為5.5 g/L，同理，大蒜素對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(ρ2)為2.6 g/L。

2.2.1 殼聚糖、大蒜素及聯(lián)合抑菌劑的抑菌圈直徑

表2 ρ1濃度下殼聚糖、 ρ2濃度下大蒜素及聯(lián)合 抑菌劑的抑菌圈直徑Table 2 The inhibitory zone diameters of chitosan in ρ1 and allicin in ρ2 and the combined antibacterial agents

注：不同小寫字母表示LSD檢驗(yàn)在5%水平上差異顯著；表3同。

2.2.2 殼聚糖、大蒜素及聯(lián)合抑菌劑的抑菌率

表3 ρ1濃度下殼聚糖、 ρ2濃度下大蒜素及聯(lián)合 抑菌劑的抑菌率Table 3 The inhibitory rate of chitosan in ρ1 and allicin in ρ2 and the combined antibacterial agents

以ρ1濃度殼聚糖與ρ2濃度的大蒜素配制成聯(lián)合抑菌劑，由表2與表3數(shù)據(jù)可知，殼聚糖與大蒜素聯(lián)用后對(duì)4種病原菌的抑菌圈直徑與抑菌率均有所增加，抑菌活性有所提高(p<0.05)。

2.3 聯(lián)合抑菌劑的穩(wěn)定性

2.3.1 溫度對(duì)聯(lián)合抑菌劑抑菌活性的影響

由圖1、圖2可知，聯(lián)合抑菌劑的抑菌活性在40 ℃下保持良好，經(jīng)50 ℃處理有小幅下降，60 ℃處理后抑菌活性有顯著下降(p<0.05)，在70 ～90 ℃處理后，抑菌活性下降嚴(yán)重(p<0.05)。

圖1 溫度對(duì)聯(lián)合抑菌劑抑菌圈直徑的影響Fig.1 The effect of temperature on the inhibitory zone diameters of combined antibacterial agents

圖2 溫度對(duì)聯(lián)合抑菌劑抑菌率的影響Fig.2 The effect of temperature on the inhibitory rate of combined antibacterial agents

2.3.2 pH對(duì)聯(lián)用抑菌劑抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖3和圖4分析可知，聯(lián)合抑菌劑在pH值在5～8之間抑菌活性較高，因此，聯(lián)合抑菌劑適于在中性pH值條件下發(fā)揮抑菌活性。

圖3 pH值對(duì)聯(lián)合抑菌劑抑菌圈直徑的影響Fig.3 The effect of pH on the inhibitory zone diameters of combined antibacterial agents

圖4 pH值對(duì)聯(lián)合抑菌劑抑菌率的影響Fig.4 The effect of pH on the inhibitory rate of combined antibacterial agents

2.3.3 紫外照射對(duì)聯(lián)用抑菌劑抑菌活性的影響

由圖5和圖6可知，隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，聯(lián)合抑菌劑的抑菌活性不斷下降。受紫外線照射20 min內(nèi)，抑菌活性只有小幅下降。

圖5 紫外線照射時(shí)間對(duì)聯(lián)合抑菌劑抑菌圈直徑的影響Fig.5 The effect of ultraviolet light irradiation time on the inhibitory zone diameters of combined antibacterial agents

圖6 紫外線照射時(shí)間對(duì)聯(lián)合抑菌劑抑菌率的影響Fig.6 The effect of ultraviolet light irradiation time on the inhibitory rate of combined antibacterial agents

2.4 聯(lián)合抑菌劑在伽師瓜貯藏過(guò)程中抗菌防腐爛作用

2.4.1 在伽師瓜貯藏過(guò)程中聯(lián)合抑菌劑對(duì)4種病原菌的抗菌防腐爛作用

由圖7可知，在50 d時(shí)，對(duì)照組腐爛率為98.5%，處理組腐爛率僅為14.3%。處理組在貯藏120 d時(shí)，腐爛率達(dá)到97.9%，對(duì)照組腐爛速度顯著高于處理組(p<0.05)。

圖7 伽師瓜貯藏過(guò)程中聯(lián)合抑菌劑對(duì)4種病原菌的 抗菌作用Fig.7 Antibacterial effect of combined antibacterial agents on four pathogenic bacteria in the storage of Jiashi melon

2.4.2 聯(lián)合抑菌劑對(duì)樣本自帶與貯藏環(huán)境的病原菌的抗菌防腐爛作用

由圖8可知，在20 ℃下，對(duì)照組中伽師瓜未采取抗菌措施，腐爛速度較快，70 d時(shí)全部腐爛，處理組70 d時(shí)腐爛率僅為25.1%，120 d時(shí)，全部腐爛，兩者差異顯著(p<0.05)。

在相同的貯藏時(shí)間，圖7比圖8中對(duì)照組腐爛率高，這是由于圖7中的所有樣本都專門致腐敗較強(qiáng)的病原菌，所以，腐爛率較高；而圖8中的樣本并非全部都帶有致腐敗病菌，且致腐敗能力不確定，因而腐爛率較低。

圖8 聯(lián)合抑菌劑對(duì)樣本自身與貯藏環(huán)境病原菌的 抗菌作用Fig.8 Antimicrobial effect of combined antibacterial agents on pathogenic bacteria which in samples of Jiashi melon and in the storage environment

3 討論

抑菌劑的穩(wěn)定性是重要的性能指標(biāo)，殼聚糖熱穩(wěn)定性較好[31]，高溫處理后仍能保持抑菌活性。大蒜素抑菌活性強(qiáng)，但熱穩(wěn)定性差，高溫下抑菌活性大幅下降甚至消失[32]。高溫下，大蒜素抑菌活性急劇下降，對(duì)聯(lián)合抑菌劑整體的抑菌活性影響較大，殼聚糖仍能保持穩(wěn)定的抑菌活性。因此，如圖1與圖2所示，聯(lián)合抑菌劑的抑菌活性在50～70 ℃之間快速下降，在70～90 ℃之間則下降緩慢。此外，聯(lián)合抑菌劑在pH值5～8之間、紫外光照射20 min后，能保持較強(qiáng)的抑菌活性，抑菌穩(wěn)定性良好。

微生物侵染是導(dǎo)致甜瓜腐爛的主要原因[15]，微生物生長(zhǎng)繁殖分為遲緩期、對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期、平穩(wěn)期，在經(jīng)歷遲緩期，達(dá)到一定數(shù)量密度后進(jìn)入快速增長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期[33]，聯(lián)合抑菌劑大量殺滅樣本表面病原菌，推遲病原菌進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期。在針對(duì)4種病原菌的抗菌貯藏過(guò)程中，如圖7所示，對(duì)照組腐爛率上升速度較處理組快。在實(shí)際貯藏保鮮過(guò)程中，微生物復(fù)雜繁多，難以做到全部分離分析，且產(chǎn)地、貯藏環(huán)境等因素都會(huì)增加病原菌種類的不確定性。對(duì)伽師瓜普通樣本的抗菌貯藏，結(jié)果如圖8所示，20 ℃下貯藏70 d后處理組腐爛率僅為25.1%，對(duì)照組則全部腐爛。由此可知，聯(lián)合抑菌劑具有廣譜抑菌活性。由于聯(lián)合抑菌劑組分中殼聚糖有成膜特性，能形成一層抑菌保護(hù)膜，阻止后續(xù)病原菌的侵入，進(jìn)一步降低了腐爛率，延長(zhǎng)了保鮮期[34]。因此，圖7與圖8的處理組樣本的保鮮期均達(dá)到120 d，差異不顯著。

4 結(jié)論

殼聚糖、大蒜素對(duì)伽師瓜貯藏過(guò)程中常見(jiàn)的致腐敗病原菌均有抑菌作用，2種抑菌劑聯(lián)用有更強(qiáng)的抑菌活性，同時(shí)，聯(lián)合抑菌劑有良好的抑菌穩(wěn)定性。在伽師瓜貯藏過(guò)程中使用聯(lián)合抑菌劑，能夠顯著的降低果實(shí)腐爛率，并延長(zhǎng)保鮮期。因此，殼聚糖-大蒜素聯(lián)合抑菌劑適用于伽師瓜抗菌貯藏保鮮，對(duì)其他種類瓜果蔬菜的抗菌貯藏保鮮也有參考意義。