改性葡甘露聚糖/海藻酸鈉微囊體外釋藥研究

方坤，李堅斌,2*，魏群舒，聶卉，劉培華，陳雨，江寧寧

1(廣西大學 輕工與食品工程學院，廣西 南寧，530004) 2(廣西蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧，530004)

魔芋葡甘露聚糖(koniacglucomannan，KGM)是由分子比為1∶1.6的D-葡萄糖和D-甘露糖殘基以β-1，4-糖苷鍵聚合而形成的大分子多糖，其平均分子質(zhì)量大約為1 000KDa[1-2]。由于其具有良好的成膜，生物相容性，生物降解性和凝膠性能[3-5]，因此，常用作食品原料和食品添加劑[6-8]。但是，由于葡甘露聚糖分子量大、水溶性差、水溶膠不穩(wěn)定，特別是在高溫和冷凍條件下穩(wěn)定性極差，使其應(yīng)用受到限制[9]，所以研究中通常需要對KGM進行改性，如羧甲基化等[10]。改性后制成的的羧甲基魔芋葡甘露聚糖(carboxymethylkonjacglucomannan，CMKGM)具有良好的拉伸、凝膠等性能[11-12]。

海藻酸鈉(sodiumalginate，簡稱SA)是由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸按(1→4)鍵連接而成的多糖[13]。SA因為其水溶液具有好的凝膠性、穩(wěn)定性和高黏性，所以在食品，化妝品和制藥工業(yè)中常用作添加劑和輔助劑[14-16]。此外，SA由于其低毒性和優(yōu)異的生物相容性而被廣泛應(yīng)用于制備生物醫(yī)學材料[17-20]。

微囊是緩/控釋制劑中常見的劑型，其包裹藥物成囊的優(yōu)點有：克服藥物自身的缺陷，達到控制藥物的釋放，提高藥物的生物相容性和穩(wěn)定性等,近年來受到廣泛關(guān)注[21-23]。WANG等[24]用KGM、海藻酸鈉和殼聚糖作為囊材，以牛血清白蛋白和胰島素為模型藥物，制備控釋微球。研究表明微球中包含魔芋葡甘露聚糖，SA和KGM之間存在弱的氫鍵和靜電作用，載藥量隨KGM質(zhì)量的增加而增加。WU等[25]研究出新型纖維素硫酸鈉-殼聚糖-聚磷酸鈉微囊，以5-氨基水楊酸為模型藥物。體外溶脹和釋放分析表明，藥物優(yōu)先釋放在模擬結(jié)腸液中，表明微囊是一種結(jié)腸靶向釋藥載體。本文以牛血清蛋白(BSA)為模型藥物，研究CMKGM/SA微囊的體外釋放，以及各因素對微囊緩釋性的影響，研究微囊在人工模擬消化液中的釋放性質(zhì)，對微囊的結(jié)腸定位釋藥特性進行評價，并對微囊體外釋放進行模型擬合，為蛋白質(zhì)類藥物的結(jié)腸靶向給藥的進一步研究做基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魔芋葡甘露聚糖，北海多環(huán)保健品有限公司；海藻酸鈉，成都市科龍化工試劑廠；牛血清蛋白、氯乙酸鈉、HCl、NaOH、KH2PO4等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2802S 紫外可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司；HJ-3數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，上海鴻都電子科技有限公司；868酸度計，美國Orion公司；AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 CMKGM的制備

取5.0 g KGM置于500 mL三口燒瓶的乙醇溶液中，加入NaOH溶液，攪拌。經(jīng)過堿化的KGM加入氯乙酸鈉(氯乙酸與氫氧化鈉反應(yīng)得到的鈉鹽)的乙醇溶液，使氯乙酸與KGM質(zhì)量比分別為0.25∶1、1∶1、2∶1，攪拌，用1.0 mol/L的鹽酸溶液，調(diào)節(jié)pH至7.0，減壓抽濾，用體積分數(shù)為60%和80%的乙醇及和無水乙醇溶液洗滌濾餅數(shù)次，40.0℃下真空干燥，得到白色粉末產(chǎn)物，將其編號為CMKGM1，CMKGM2，CMKGM3。

1.3.2 CMKGM/SA微囊的制備

取CMKGM∶SA(質(zhì)量比)為3∶1，將所得CMKGM溶于去離子水中，攪拌，加入SA繼續(xù)攪拌，稱取牛血清蛋白(BSA)，加入攪拌均勻，用1 mL注射器以30 r/min的速度滴入CaCl2溶液中，固化，去離子水沖洗，真空干燥，得到1#微囊(CMKGM1)、2#微囊(CMKGM2)和3#微囊(CMKGM3)。

1.3.3 取代度的測定

酸化滴定法是羧甲基取改性產(chǎn)物取代度測定的常用方法[26]。稱取CMKGM 1.0 g，溶于40.0 mL的2.0 mol/L鹽酸溶液，磁力攪拌，過濾，用無水乙醇洗滌樣品，直至濾液用硝酸銀檢測無氯離子為止。量取0.1 mol/L的NaOH標準溶液40.0 mL，溶解CMKGM，微熱，即用0.1 mol/L的HCl溶液滴定NaOH，用酚酞作指示劑，記錄消耗的HCl溶液體積。

A=(CNaOH×VNaOH-CHCl×VHCl)/m

(1)

DS=A×0.162/(1-0.058A)

(2)

式中：A，1.0 g樣品所消耗的NaOH的量，mmol；m，稱樣量，g；DS，取代度；0.162，KGM的失水葡萄糖(或甘露糖)單元的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol；0.058，失水葡萄糖(或甘露糖)單元的一個羥基被羧甲基取代后單元毫摩爾質(zhì)量的凈增量，g/mmol。

1.3.4 CMKGM的表面形貌觀察

將干燥后的CMKGM樣品固定在雙面導(dǎo)電膠上，在真空下對樣品進行離子濺射噴金處理，用F16502電子掃描顯微鏡(SEM)選擇合適的倍數(shù)觀察CMKGM形貌。

1.3.5 微囊體外釋放性能的測定

1.3.5.1 人工模擬消化液的配制

(1)人工模擬胃液(SGF)的配制

取9.0 mL的濃Hcl，用去離子水稀釋，定容至1 000.0 mL，去除雜質(zhì)，用0.1 mol/L的NaOH標準溶液調(diào)節(jié)pH至1.0。

(2)人工模擬小腸液(SIF)的配制

取13.6 g的KH2PO4溶于去離子水中，定容至1 000.0 mL，去除雜質(zhì)，用0.1 mol/L的NaOH標準溶液調(diào)節(jié)pH至6.8。

(3)人工模擬結(jié)腸液(SCF)的配制

取6.8 g的KH2PO4溶于去離子水中，定容至1 000.0 mL，去除雜質(zhì)，用0.1 mol/L的NaOH標準溶液調(diào)節(jié)pH至7.4。

1.3.5.2 BSA標準曲線的繪制

用去離子水配制一系列不同濃度的BSA溶液，首先進行全波長掃描，確定最大吸收峰在279 nm波長處。在279 nm波長處，以去離子水作為參比溶液，測定BSA溶液的吸光度(A)。然后以濃度為縱坐標，以吸光度(A)為橫坐標，作BSA濃度和吸光度的關(guān)系曲線，線性擬合得到標準曲線方程為：

C=1 680.8A+1.836 5R2=0.999 7 (SGF)

(3)

C=1 621.2A+2.858 2R2=0.999 6 (SIF)

(4)

C=1 564.5A+2.637 2R2=0.999 8 (SCF)

(5)

1.3.5.3 微囊內(nèi)藥物含量的測定

取CMKGM/SA微囊，準確稱量、研細，置于500 mL容量瓶中，加入人工模擬消化液，搖勻，于37.0 ℃水浴中加入完全溶解，冷卻至室溫，定容，搖勻，在279 nm處用紫外分光光度計測定吸光度。

1.3.5.4 BSA體外釋放度的測定

《中華人民共和國藥典》2010年版第二部，體外釋放度試驗方法的第一法用來測定BSA的累積釋放率，將CMKGM/SA微囊置于500 mL釋放液中，溫度為(37.5±0.5)℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min。每小時取樣1次，在30 s內(nèi)完成取樣，并且補充相同體積、相同溫度的人工模擬液。樣液經(jīng)0.5 μm微孔濾膜過濾，以模擬液作為參比溶液，在最大吸收波長279 nm處測定吸光度。累積釋藥率(accumulation release percentage，ARP)用式(6)計算：

(6)

式中：ARP，t時間內(nèi)藥物的累積釋放率；Mt，藥物在t時間內(nèi)釋放液中的累積濃度；M∞，藥物完全釋放時釋放液中的濃度。

1.3.6 微囊體外釋放模型

微囊的體外釋放可用表1中的模型進行擬合，R為相關(guān)系數(shù)，越趨向于1表明曲線的擬合效果越好[27]。

表1 微囊體外釋放數(shù)學擬合模型Table 1 Model fitting equation of in vitro release of microcapsule

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5進行實驗數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 CMKGM的取代度

由1.3.1的方法制備得到CMKGM，取代度結(jié)果如表2所示。

表2 CMKGM的取代度Table 2 Degree of substitution of CMKGM

由表2可知，隨著氯乙酸與KGM比例的升高，CMKGM的取代度也隨之升高，最高達到75%。

2.2 CMKGM形貌觀察

圖1-a為KGM的形貌，其顆粒大小雜亂不一，結(jié)構(gòu)不緊密。由圖1-b、1-c、1-d可以看出：隨著取代度增大，CMKGM結(jié)構(gòu)比KGM結(jié)構(gòu)更加緊密，顆粒體積有所增大。因為隨著取代度的增加，CMKGM分子內(nèi)部基團之間的作用力增大，結(jié)合更牢固，表現(xiàn)出顆粒體積增大，質(zhì)地緊密，這有利于延長其作為囊材的緩釋時間。

圖1 KGM和CMKGM的電鏡掃描圖Fig.1 SEM of KGM and CMKGM

2.3 微囊體外釋放性能的研究

2.3.1 微囊的體外釋放曲線

根據(jù)蛋白類藥物易被體內(nèi)的酶水解，在循環(huán)系統(tǒng)中停留時間短等特點，選擇12 h作為研究時間，研究其體外釋放。選擇去離子水為微囊藥物的釋放液，測定藥物累積釋放度，繪制1#微囊、2#微囊和3#微囊的藥物的體外釋放曲線，結(jié)果如圖2所示。

圖2 微囊體外釋放曲線Fig.2 Release curve of microcapsule in vitro

由圖2可知，1#微囊、2#微囊和3#微囊的藥物在0～5 h時緩慢釋放，累積釋放度分別為40.3%、25.3%和19.8%，藥物在6～9 h持續(xù)釋放，10～12 h時釋放基本趨于平緩，在12 h后的累積釋放度分別為91%、89.9%和82%。2#微囊和3#微囊具有緩釋效果，因為隨著取代度增大，分子內(nèi)羧甲基數(shù)量增多，CMKGM和SA協(xié)同作用加強，可以很好地包裹藥物。

2.3.2 CMKGM與SA質(zhì)量比對微囊釋放性能的影響

通過研究1#微囊、2#微囊和3#微囊的體外釋放可知，2#微囊和3#微囊具有緩釋效果，并且3#微囊在12 h后的累積釋放率達到90%。因此，選擇3#微囊，研究CMKGM和SA的質(zhì)量比對微囊釋放性能的影響。

由圖3可知，CMKGM∶SA(質(zhì)量比)為1∶1、2∶1、3∶1和4∶1時，微囊的藥物釋放具有緩釋性，藥物在0～5 h時緩慢釋放，累積釋放度分別為14%、20%、23.6%和26.3%，藥物在6～9 h持續(xù)釋放，10～12 h時釋放基本趨于平緩，在12 h后的累積釋放度分別為72%、80%、86%和90%。隨著CMKGM∶SA的增加，制備的微囊緩釋效果越來越低，當CMKGM∶SA(質(zhì)量比)為5∶1時，微囊的釋放幾乎呈線性。是因為隨著CMKGM∶SA(質(zhì)量比)的增加，CMKGM與SA之間的協(xié)同作用達到飽和，結(jié)構(gòu)不緊密，不能很好地包裹藥物，水分很容易滲入，藥物釋放達不到緩釋的效果。

圖3 CMKGM與SA質(zhì)量比微囊體外釋放曲線Fig.3 Release curve of microcapsule in vitro of mass ratio of CMKGM and SA

2.3.3 BSA質(zhì)量對微囊釋放性能的影響

選擇3#微囊，研究BSA質(zhì)量對微囊釋放性能的影響。

由圖4可知，BSA質(zhì)量為20.0 mg和30.0 mg時，微囊的藥物釋放具有緩釋性，藥物在0～5 h時緩慢釋放，累積釋放度分別為18%和27%，藥物在6～9 h持續(xù)釋放，10～12 h時釋放基本趨于平緩，在12 h后的累積釋放度分別為80%和92%。BSA為40.0 mg時，微囊的藥物釋放不具有緩釋效果。因為隨著BSA質(zhì)量的增加，囊材包裹不完全，導(dǎo)致藥物出現(xiàn)突釋，達不到緩釋的效果。

2.3.4人工模擬消化液中微囊的體外釋放曲線

由圖5可知，在SGF中，藥物釋放很緩慢，12 h后的累積釋放度為18.5%。在SIF中，0～4 h時藥物釋放較為緩慢，累積釋放度達到13%，12 h后累積釋放度達到50%。在SCF中，0～4 h時藥物釋放較為緩慢，累積釋放度達到18%，隨著時間的增加，藥物釋放幾乎呈線性，12 h后累積釋放度為86%，達到蛋白類藥物的緩釋效果。

圖4 BSA質(zhì)量對微囊體外釋放曲線的影響Fig.4 Release curve of microcapsule in vitro with different BSA’s quality

圖5 人工模擬消化液中微囊的體外釋放曲線Fig.5 Release curve of microcapsule in vitro with Artificial simulation digestive juices

2.4 微囊體外釋藥特性的擬合模型

研究在人工模擬消化液中微囊的體外釋放曲線可知，制備的微囊在SCF中具有很好的緩釋效果。選取CMKGM3，CMKGM∶SA為3∶1，BSA質(zhì)量為30.0 mg，制備微囊，對其體外釋放進行模型擬合。在SCF中微囊的累積釋放數(shù)據(jù)見表3。

表3 微囊體外累積釋放率Table 3 ARP of in vitro ralease of microcapsule

由表4中相關(guān)系數(shù)R值可以看出，Higuchi方程更擬合藥物體外釋放行為，藥物釋放釋藥以Fick擴散為主。由微囊的釋放曲線可知，當累積釋放度達到50%時，時間為7.5 h左右，符合Higuchi方程擬合的結(jié)果。圖6為BSA微囊體外釋放的Higuchi模型擬合結(jié)果。

由圖6可知，用Higuchi模型對2#微囊體外釋放數(shù)據(jù)進行擬合，BSA釋放曲線與Higuchi模型的擬合理論曲線比較接近。

3 結(jié)論

微囊體外釋放研究表明，1#微囊、2#微囊和3#微囊的藥物在0～5 h時緩慢釋放，6～9 h時持續(xù)釋放，在10～12 h時釋放基本趨于平緩，12 h后的累積釋放分別為91%、89.9%和82%。由于2#微囊和3#微囊所用改性后的CMKGM取代度較大，而SEM顯示，CMKGM結(jié)構(gòu)比KGM結(jié)構(gòu)更加緊密，顆粒體積增大，故具有良好的緩釋效果。CMKGM和SA的質(zhì)量比對3#微囊體外釋放的影響結(jié)果表明，CMKGM∶SA(質(zhì)量比)為1∶1、2∶1、3∶1和4∶1時，微囊的藥物釋放具有緩釋效果，藥物在0～5 h時緩慢釋放，6～9 h時持續(xù)釋放，藥物在10～12 h時釋放基本趨于平緩。BSA質(zhì)量對微囊體外釋放的影響結(jié)果表明，當BSA為20.0和30.0 mg時，微囊的藥物釋放具有緩釋效果，藥物在0～5 h時緩慢釋放，在6～9 h時，藥物持續(xù)釋放，在10～12 h時釋放基本趨于平緩。微囊在人工模擬消化液的體外釋放結(jié)果表明：在SGF中，藥物釋放很緩慢，12 h后的累積釋放度為18.5%。在SIF中，0～5 h時藥物釋放較為緩慢，累積釋放度達到13%，6～9 h時持續(xù)釋放，12 h后累積釋放度達到50%。在SCF中，0～5 h時藥物釋放較為緩慢，累積釋放度達到18%，6～12 h時持續(xù)釋放，藥物釋放幾乎呈線性，12 h后累積釋放度為86%。微囊體外釋放模型擬合發(fā)現(xiàn)，Higuchi方程更擬合藥物體外釋放行為，藥物釋放藥以Fick擴散為主。

表4 微囊體外釋放模型的模擬結(jié)果及相關(guān)參數(shù)Table 4 Fitting results and relative parameters of in vitro ralease of microcapsule

圖6 BSA微囊體外釋放的模型擬合Fig.6 Model fit of BSA release from microcapsule