SPE凈化-同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定乳與乳制品中生物素的含量

◎ 陶大利，白 鶴，李 琴

（農(nóng)業(yè)部乳品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（哈爾濱），黑龍江 哈爾濱 150090）

生物素（Biotin）又稱維生素H、維生素B7、輔酶R等，是一種水溶性B族維生素。生物素是構(gòu)成羧化酶的重要輔酶[1]，參與人體內(nèi)脂肪、糖類和氨基酸的代謝[2]，對(duì)于維持機(jī)體正常生理功能有重要的作用，已廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥、維生素制劑、飼料添加劑、運(yùn)動(dòng)飲料、嬰幼兒配方食品等方面，同時(shí)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)臨床和發(fā)酵工業(yè)中，也等到了廣泛的應(yīng)用[3]。

目前有關(guān)生物素的檢測(cè)很多，有文獻(xiàn)報(bào)道的方法有微生物法[4-6]、液相色譜法[7-9]、酶聯(lián)免疫法[10]、熒光免疫層析法[11]、液質(zhì)聯(lián)用法[12-14]。其中，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用，對(duì)低含量生物素樣品的定量測(cè)定起到了很大的推動(dòng)作用。本研究采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，同時(shí)采用內(nèi)標(biāo)法定量，針對(duì)乳制品研究了前處理方法，適用于乳與乳制品中生物素的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀（waters，TQ）、精密電子天平（梅特勒托利多，ML204）、渦旋混合器（IKA，MS3）、高速冷凍離心機(jī)（SIGMA，3-30K）、自動(dòng)固相萃取儀（吉爾森，GX274）、氮吹儀（Thermo，T18010）、超純水系統(tǒng)（Thermo）、HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL）。

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、正己烷（色譜純）、甲酸（色譜純）、冰乙酸（優(yōu)級(jí)純）、生物素標(biāo)準(zhǔn)品、生物素D4標(biāo)準(zhǔn)品，所使用實(shí)驗(yàn)用水均為一級(jí)水。

1.2 樣品前處理

1.2.1 提取

稱取5 g奶粉或20 g液態(tài)乳于50 mL容量瓶中，奶粉用40 ℃水充分溶解，加入20%醋酸1 mL，混勻超聲5 min，放置至室溫后定容過(guò)濾，取20 mL左右濾液于50 mL離心管中，加入20 mL水飽和的正己烷，充分振蕩，放入離心機(jī)5 000 r·min-1離心5 min，取10 mL下層清液，上自動(dòng)固相萃取儀凈化。

1.2.2 凈化

分別用3 mL甲醇、3 mL一級(jí)水活化HLB固相萃取柱，取10 mL提取液上樣，3 mL一級(jí)水淋洗，吹干，用3 mL甲醇洗脫，全部收集洗脫液，整個(gè)過(guò)程控制流速在 1 mL·min-1以內(nèi)，加入 2 μg·mL-1生物素 D4內(nèi)標(biāo)溶液100 μL，45 ℃氮吹至近干，用10%乙腈水溶液10 mL溶解，如做生鮮乳可適當(dāng)調(diào)整溶解液的體積，過(guò)0.22 μm濾膜，使用液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)試。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

分別移取生物素標(biāo)準(zhǔn)溶液（500 ng·mL-1）0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL和1.0 mL于10 mL容量瓶中，分別加入2 μg·mL-1生物素D4溶液100 μL，用10%乙腈水溶液定容至刻度混勻，濃度分別為5、10、20、30、40 ng·mL-1和 50 ng·mL-1；生物素 D4內(nèi)標(biāo)濃度與樣品相同。

1.3 儀器條件

色譜柱：BEH C1850 mm×2.1 mm，1.7 μm；流動(dòng)相：0.1%甲酸水與乙腈梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1。毛細(xì)管電壓：3.3 kV；錐孔電壓：24 kV；脫溶劑氣溫度：450 ℃；脫溶劑氣流量：650 L·h-1；離子源溫度：150 ℃；生物素：245＞97（定性），碰撞能量27 V，245＞227（定量），碰撞能量27 V；生物素D4：249＞231，碰撞能量17 V。生物素及生物素內(nèi)標(biāo)選擇離子譜圖見(jiàn)圖1、圖2。

表1 梯度洗脫程序表

圖1 生物素和生物素內(nèi)標(biāo)選擇離子譜圖

圖A、B為生物素兩對(duì)選擇離子譜圖，圖C為生物素內(nèi)標(biāo)選擇離子譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取的選擇

生物素是一種水溶性維生素，而乳制品中含有一定量的蛋白質(zhì)、脂肪，所以在提取目標(biāo)物的同時(shí)樣品需去除蛋白質(zhì)獲得澄清溶液才能進(jìn)行測(cè)定操作。參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.259-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物素的測(cè)定》，乳類、嬰兒配方食品使用檸檬酸緩沖液或3%硫酸溶液，經(jīng)121 ℃高壓水解15 min提取，調(diào)酸沉淀蛋白質(zhì)的方法。李菁菁[12]采用水提取，采用三氯甲烷沉淀蛋白質(zhì)；王鳳玲[13]采用水提取，采用鹽酸調(diào)pH值沉淀蛋白質(zhì)。三氯甲烷沉淀樣品測(cè)試波動(dòng)大重現(xiàn)性差，使用國(guó)標(biāo)方法提取沉淀與醋酸、高氯酸、鹽酸沉淀測(cè)試結(jié)果沒(méi)有明顯差異，而且操作繁瑣，在3種酸的比較中，醋酸為弱酸，具有一定緩沖能力，不用調(diào)節(jié)pH值，只需加入固定量即可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)沉淀，操作最為簡(jiǎn)便。最終確定以水提取，使用20%醋酸1 mL沉淀蛋白。

2.2 樣品的凈化

在測(cè)定乳制品中生物素，很多文獻(xiàn)均采用沉淀蛋白質(zhì)后直接上機(jī)測(cè)試，但超高效液相色譜柱填料顆粒僅有1.7μm左右，樣品不凈化容易造成色譜柱的污染和阻塞，影響色譜柱的壽命同時(shí)也容易造成離子源的污染增加儀器維護(hù)保養(yǎng)成本。本研究發(fā)現(xiàn)，HLB固相萃取柱對(duì)生物素有較強(qiáng)保留，可以有效的凈化樣品，測(cè)試了60、200、500 mg這3個(gè)規(guī)格的SPE柱，上樣量10 mL時(shí)在60 mg SPE柱也不會(huì)過(guò)載造成損失，考慮檢測(cè)成本的問(wèn)題選擇60 mg/3 mL的HLB固相萃取柱即可實(shí)現(xiàn)凈化。

2.3 儀器條件的選擇

液相條件下在流動(dòng)相的選擇上，梁慧敏[14]采用乙腈-0.1%甲酸10 mmol·L-1乙酸銨；但也有采用乙腈-0.1%甲酸水溶液[15]，表明流動(dòng)相中添加乙酸胺對(duì)色譜峰峰形及靈敏度沒(méi)有促進(jìn)作用，同時(shí)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明乙腈-0.1%甲酸水比甲醇-0.1%甲酸水靈敏度更高。

質(zhì)譜條件下，生物素采用電噴霧源正離子檢測(cè)方式，配制1.0 μg·mL-1的生物素標(biāo)準(zhǔn)溶液，調(diào)節(jié)毛細(xì)管電壓和錐孔電壓得到響應(yīng)較強(qiáng)的質(zhì)量數(shù)245作為母離子。然后對(duì)母離子進(jìn)行子離子掃描，調(diào)節(jié)碰撞能量，選擇響應(yīng)較高的2個(gè)子離子作為定性定量離子。其中響應(yīng)高質(zhì)量數(shù)227的作為定量離子，另質(zhì)量數(shù)97作為定性離子。優(yōu)化確定適合本研究的質(zhì)譜條件。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察

在液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的應(yīng)用中基質(zhì)干擾效應(yīng)最為常見(jiàn)，且干擾程度不盡相同，在生物素的測(cè)定當(dāng)中盡管對(duì)樣品進(jìn)行的凈化，通過(guò)測(cè)試基質(zhì)效應(yīng)（ME）仍小于70%，基質(zhì)干擾不能被忽略。消除基質(zhì)效應(yīng)的方法主要有對(duì)樣品稀釋、使用基質(zhì)標(biāo)、使用內(nèi)標(biāo)，樣品稀釋過(guò)多影響方法靈敏度，而生物素普遍存在于乳中，乳制品沒(méi)有絕對(duì)的空白樣品，無(wú)法使用基質(zhì)標(biāo)的方法定量。內(nèi)標(biāo)法一直被認(rèn)為是液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)中消除基質(zhì)干擾、提高定量準(zhǔn)確度最有效的方法，因此本方法采用基質(zhì)標(biāo)的方法來(lái)消除基質(zhì)干擾實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量。

2.5 方法的驗(yàn)證

2.5.1 準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)

用本方法參加中國(guó)檢科院組織的嬰幼兒配方奶粉中生物素的能力驗(yàn)證能，兩個(gè)樣品結(jié)果分別為24.5 μg/100 g和39.4 μg/100 g，Z= +0.4和+0.7，Z＜2為滿意結(jié)果。用本方法測(cè)定了生鮮乳中生物素含量，結(jié)果在1.51～2.74 μg/100 g，與劉志楠[16]測(cè)定牛奶本地中生物素含量的研究結(jié)果接近。證明該方法可以準(zhǔn)確測(cè)定乳制品中生物素的含量。

2.5.2 回收率、精密度評(píng)價(jià)

選擇已知含量樣品（24.0 μg/100 g）做空白樣品，分別添加3個(gè)不同濃度梯度（表2）標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)梯度做6個(gè)平行測(cè)試，3個(gè)濃度生物素平均回收率分別為93.7%、97.2%、94.7%，RSD分別為2.04%、1.91%、2.68%。表明本法精密度較好，適合乳制品中生物素的定量分析。

表2 加標(biāo)回收率表

2.5.3 檢出限、定量限評(píng)價(jià)

定量離子3倍信噪比（S/N）評(píng)價(jià)方法檢出限，根據(jù)1.2方法處理計(jì)算得到檢出限為0.3μg/100g；以10倍信噪比（S/N）得到方法定量限1.0μg/100g；檢出限、定量限均低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.259-2016?？捎糜诤枯^低的樣品中生物素定量分析。

3 結(jié)論

乳制品中基質(zhì)復(fù)雜，通過(guò)SPE凈化有效去除樣品中雜質(zhì)，加入同位素內(nèi)標(biāo)可消除基質(zhì)效應(yīng)的影響同時(shí)利用質(zhì)譜的高選擇性，獲得了穩(wěn)定良好的測(cè)定結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)建立了一種可以檢測(cè)乳制品中生物素含量的方法，操作過(guò)程簡(jiǎn)單靈敏度高、重復(fù)性好，適合乳制品中生物素含量的測(cè)定。