化學(xué)分析方法驗證和確認(rèn)的應(yīng)用研究

(江陰市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所； 國家船舶材料質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(江蘇)，江蘇 江陰 214434)

前言

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，新產(chǎn)品、新物質(zhì)不斷涌現(xiàn)，從而使社會對實驗室檢測能力和水平提出了更高的要求。然而，由于檢測標(biāo)準(zhǔn)無法與快速發(fā)展的檢測需求相適應(yīng)，實驗室往往需要采用非標(biāo)方法來滿足客戶的要求。另外，隨著實驗室擴(kuò)大檢測范圍或領(lǐng)域，也需要引進(jìn)一些新的檢測標(biāo)準(zhǔn)。為了確保實驗室提供的檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，實驗室應(yīng)在首次采用標(biāo)準(zhǔn)方法之前，對其進(jìn)行驗證；在首次采用非標(biāo)準(zhǔn)方法前，對其進(jìn)行確認(rèn)。如果依據(jù)的檢測方法文本中已經(jīng)給出了驗證或確認(rèn)程序，實驗室應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行該方法規(guī)定的要求；如果未給出驗證或確認(rèn)程序，或給出的程序不明確，則需進(jìn)行驗證或確認(rèn)。CNAS-CL01：2018《檢測和校準(zhǔn)實驗室能力認(rèn)可準(zhǔn)則》[1]和《檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定評審準(zhǔn)則(2015)》[2]均要求實驗室在使用標(biāo)準(zhǔn)方法和非標(biāo)準(zhǔn)方法前要進(jìn)行驗證和確認(rèn)，但其并未明確如何進(jìn)行特性參數(shù)的驗證和確認(rèn)。近幾年發(fā)布的國家標(biāo)準(zhǔn))《化學(xué)分析方法驗證確認(rèn)和內(nèi)部質(zhì)量控制要求》(GB/T 32465—2015[3])和《合格評定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗證指南》(GB/T 27417—2017[4])對化學(xué)分析方法驗證和確認(rèn)提出了指導(dǎo)性指標(biāo)的要求，然而實驗室在理解和運用這些標(biāo)準(zhǔn)時還存在不少困擾，如不同的分析方法如何獲得檢出限和定量限，準(zhǔn)確度等特性參數(shù)，如何進(jìn)行試驗及結(jié)果，如何判定等，從而導(dǎo)致實驗室在引進(jìn)新方法時無從下手，或?qū)Ψ椒ǖ尿炞C/確認(rèn)工作不到位。針對以上問題，在總結(jié)實驗室經(jīng)驗的基礎(chǔ)上結(jié)合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)，對標(biāo)準(zhǔn)方法的驗證和非標(biāo)準(zhǔn)方法的確認(rèn)方法進(jìn)行了研究并歸納整理，對廣大化學(xué)實驗室具有指導(dǎo)意義。

1 方法驗證/確認(rèn)特性參數(shù)的選擇

在化學(xué)分析實驗室引入標(biāo)準(zhǔn)分析方法時，應(yīng)驗證操作方法是否滿足該標(biāo)準(zhǔn)的要求，即證實該方法(標(biāo)準(zhǔn)方法)能在實驗室現(xiàn)有的設(shè)施設(shè)備、人員、環(huán)境等條件下獲得令人滿意的結(jié)果；實驗室引入非標(biāo)準(zhǔn)方法時，應(yīng)提供客觀證據(jù)對特定的預(yù)期用途或應(yīng)用要求是否滿足進(jìn)行認(rèn)定。對標(biāo)準(zhǔn)方法特性參數(shù)的驗證包含(但不限于)分析系統(tǒng)適應(yīng)性、空白試驗、準(zhǔn)確度、精密度、檢出限和定量限、線性及校準(zhǔn)、測量不確定度等；對非標(biāo)準(zhǔn)方法特性參數(shù)的確認(rèn)包含(但不限于)分析系統(tǒng)適用性、選擇性、耐用性、線性及校準(zhǔn)、回收率、準(zhǔn)確度和精密度、檢出限和定量限、穩(wěn)定性、測量不確定度等。實驗室可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)經(jīng)濟(jì)條件決定驗證/確認(rèn)的內(nèi)容，但至少應(yīng)滿足表1的要求。

2 方法特性參數(shù)的驗證/確認(rèn)

2.1 選擇性

一般情況下，分析方法在沒有重大干擾的情況下應(yīng)具有一定的選擇性。對于化學(xué)分析方法，在有干擾的情況下，如：基質(zhì)成分、代謝物、降解產(chǎn)物、內(nèi)源性物質(zhì)等，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。實驗室可選用下述兩種方法檢查干擾[3-4]：

表1 典型分析方法驗證/確認(rèn)參數(shù)的選擇

注：—表示參數(shù)可不評估；√ 表示該參數(shù)必須評估；a 對于痕量化學(xué)分析時，需要驗證或評估。

1)分析一定數(shù)量(至少3個)的代表性空白樣品，檢查在目標(biāo)分析物出現(xiàn)的區(qū)域是否有干擾(信號、峰等)；

2)在代表性空白樣品、標(biāo)準(zhǔn)溶液或純試劑基質(zhì)中添加一定濃度的有可能干擾分析物定性和/或定量的物質(zhì)后，再檢查在目標(biāo)分析物出現(xiàn)的區(qū)域是否有干擾。

2.2 測量范圍

方法的測量范圍應(yīng)覆蓋方法的最低濃度水平(定量限)和關(guān)注濃度水平[5]。

確認(rèn)方法測量范圍時，至少應(yīng)確認(rèn)最低濃度水平(定量限)、關(guān)注濃度水平和最高濃度水平的正確度和精密度。

測量范圍確認(rèn)及判定方式見表2。

表2 測量范圍確認(rèn)要求及判定方式

2.3 線性范圍

若方法的測量范圍呈線性，除應(yīng)滿足2.2的要求外，還應(yīng)滿足下列要求[4]：

1)采用校準(zhǔn)曲線法定量，濃度點不得小于6個(含空白濃度，標(biāo)準(zhǔn)中有規(guī)定的按標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定進(jìn)行)，濃度范圍一般應(yīng)覆蓋關(guān)注濃度的50%～150%，如需做空白時，則應(yīng)覆蓋關(guān)注濃度水平的0%～150%，每個濃度點至少重復(fù)測量2次，根據(jù)濃度值與響應(yīng)值繪制校準(zhǔn)曲線。

2)對于準(zhǔn)確定量的方法，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)不低于0.99。

2.4 檢出限和定量限

2.4.1檢出限

通常情況下，只有當(dāng)目標(biāo)分析物的含量在接近于“零”的時候才需要確定方法的檢出限或定量限。當(dāng)分析物濃度遠(yuǎn)大于定量限時，沒有必要評估方法的檢出限和定量限。但是對于那些濃度接近于檢出限和定量限的痕量和超痕量檢測，并且報告為“未檢出”時，應(yīng)確定檢出限和定量限。不同的基質(zhì)需要分別評估檢出限和定量限。

檢出限的驗證或評估可采用下列方法進(jìn)行：

1)標(biāo)準(zhǔn)方法已給出檢出限(LOD或MDL)時：

在給出的MDL濃度水平上，通過分析該濃度水平的樣品(n≥10)，以驗證給出的MDL，分析結(jié)果應(yīng)在給出的MDL(±20%)范圍內(nèi)[3]。

2)方法未給出MDL時，可選用下列一種合適的方法評估檢出限：

A.空白標(biāo)準(zhǔn)偏差法[4]

即通過分析大量的樣品空白來確定檢出限。獨立測試的次數(shù)應(yīng)不少于10次(n≥10)，計算出檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)。

檢出限(LOD)=樣品空白平均值+3s

B.國際純粹和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(IUPAC)規(guī)定對各種光學(xué)分析方法[6]，可用式(1)計算：

D.L=KSb/s

(1)

式中：

D.L—方法的最低檢出濃度；

Sb—空白多次測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差(吸光度)；

s—方法的靈敏度(即校準(zhǔn)曲線的斜率)。

為了評估，空白測定次數(shù)必須足夠多，最好能測20次以上，取k=3(相應(yīng)的置信水平大約為90%)。

C.信噪比法[4]

本方法適用于能顯示基線噪音的儀器分析方法。對于定量方法來說，由于儀器分析過程都會有背景噪音，常用的方法就是利用已知低濃度的分析物樣品與空白樣品的測量信號進(jìn)行比較，確定能夠可靠檢出的最小的濃度。

即S/N≥3

其中：

S—樣品信號值；

N—空白信號值。

D.方法分辨率法

在分光光度法中，以扣除空白值后的與0.01吸光度相對應(yīng)的濃度值為檢出限。

滴定分析中，以消耗0.02 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液所對應(yīng)的濃度或含量作為檢出限。

2.4.2定量限(報告限)

定量限(LOQ)，又稱報告限[5]，是一個限值，高于該值，定量結(jié)果的正確度和精密度可接受。一般實驗室取3～10倍檢出限作為方法的定量限[4]。

注[5]： 檢出限(LOD)。樣品中可被(定性)檢測，但并不需要準(zhǔn)確定量的最低含量(或濃度)，是在一定置信水平下，從統(tǒng)計學(xué)上與空白樣品區(qū)分的最低濃度水平(或含量)。

MDL：方法檢出限。通過分析方法全部檢測過程后(包括樣品預(yù)處理)，目標(biāo)分析物產(chǎn)生的信號能以一定的置信度區(qū)別于空白樣品而被檢測出來的最低濃度或含量。

2.4.3檢出限的利用

檢出限是分析測試的重要指標(biāo)，是分析方法的重要基本參數(shù)之一。在日常檢測過程中，檢出限的確定和利用對實驗室報出準(zhǔn)確檢測結(jié)果和規(guī)避風(fēng)險具有十分重要的意義。實驗室評估出方法檢出限后，可參照以下三種情況利用檢出限：

1)如檢出限等于或略小于標(biāo)準(zhǔn)分析方法所規(guī)定的檢出限，則仍采用規(guī)定值。

2)如檢出限顯著偏低并被多次測定證實其穩(wěn)定性很好，也可改用此實測值，但必須在報告中加以說明。

3)如檢出限大于標(biāo)準(zhǔn)分析方法的規(guī)定值，則表明空白試驗值不合格，應(yīng)找出原因并加以改正，直至小于等于規(guī)定值后，實驗才能繼續(xù)進(jìn)行。

實驗室檢測結(jié)果的表述方式可以分為三種情況(表3)。

2.5 精密度

精密度反映了分析方法或測量系統(tǒng)存在的隨機誤差的大小，測試結(jié)果的隨機誤差越小，測試的精密度越高。精密度通常以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。

在考察精密度時應(yīng)注意以下幾個問題：

1)分析結(jié)果的精密度與樣品中待測物質(zhì)的濃度水平有關(guān)，因此，必要時應(yīng)取兩個或兩個以上不同濃度水平的樣品進(jìn)行分析方法精密度檢查；

2)標(biāo)準(zhǔn)偏差的可靠程度受測量次數(shù)的影響，因此，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差時需要足夠多的測量次數(shù)，一般要求至少重復(fù)測定6次，計算時應(yīng)剔除離群值[7]；

3)標(biāo)準(zhǔn)中對精密度有要求的，應(yīng)滿足標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定；若標(biāo)準(zhǔn)中無精密度要求，其重復(fù)測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)滿足表4的要求[4]。

表3 檢測結(jié)果的表述方式

表4 實驗室內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

注：1)單位為mg/kg，2)單位為%。

2.6 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度是反映方法系統(tǒng)誤差和隨機誤差的總和指標(biāo)，它決定著這個分析結(jié)果的可靠性。準(zhǔn)確度用絕對誤差或相對誤差表示。

2.6.1標(biāo)準(zhǔn)樣品分析法

通過分析標(biāo)準(zhǔn)樣品，由所得結(jié)果了解分析的準(zhǔn)確度。如果標(biāo)準(zhǔn)中有對準(zhǔn)確度的判定方式，則按標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，如無，可用下列方式進(jìn)行判定。

1)CD0.95(臨界差)法[8]

用于測量的標(biāo)準(zhǔn)方法提供有可靠的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差σr和復(fù)現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差σR時，可采用CD值進(jìn)行評價，標(biāo)準(zhǔn)方法的臨界CD值為式(2)：

(2)

注：r=2.8σr，R=2.8σR

2)En值(又稱歸一化偏差)法[9]

當(dāng)實驗室能夠?qū)λ鶛z測項目進(jìn)行正確的不確定度評定時，可使用En值對結(jié)果評價，見式(3)。

(3)

當(dāng)En≤1，則表明實驗室的結(jié)果滿意，否則為不滿意。

3)Z值法

在CD0.95值和En值不可獲得時，如相關(guān)專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測試結(jié)果的允許差，可按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定評價。計算Z值，見式(4)。

(4)

式中：

Xlab為實驗室測量結(jié)果；

Xref為標(biāo)準(zhǔn)品或控制樣品的參考值；

Δ為標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的允許差。

若|Z|≤1，則測試結(jié)果為滿意結(jié)果，否則為不滿意結(jié)果。

4)重復(fù)分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，測定含量平均值與真值的偏差指導(dǎo)范圍見表5[10]。

表5 測定值與真值的偏差指導(dǎo)范圍

2.6.2加標(biāo)回收率測定法[4,10]

1)在樣品中加入一定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測其回收率。

按下式計算回收率P：

回收率P/%=(加標(biāo)試樣測定值-試樣測定值)/加標(biāo)量×100%

2)進(jìn)行加標(biāo)回收時，應(yīng)注意以下幾點：

(1)加標(biāo)物質(zhì)的形態(tài)應(yīng)該和待測物的形態(tài)相同；

(2)回收率應(yīng)在方法測定低限、兩倍方法測定低限和十倍方法測定低限進(jìn)行三水平試驗；

(3)任何情況下加標(biāo)量均不得大于待測物含量的3倍(一般取0.5～2倍)；

(4)當(dāng)樣品中待測物濃度高于校準(zhǔn)曲線的中間濃度時，加標(biāo)量應(yīng)控制在待測物濃度的半量。

3)回收率的參考范圍見表6[4]：

表6 回收率范圍

2.6.3與已有方法比較法

通常認(rèn)為，不同原理的分析方法具有相同不準(zhǔn)確度的可能性極小，當(dāng)對同一樣品用不同原理的分析方法測定，并獲得一致的測定結(jié)果時，可將其作為真值的最佳估計。

當(dāng)用不同分析方法對同一樣品進(jìn)行重復(fù)測定時，若所得結(jié)果一致，或經(jīng)統(tǒng)計檢驗標(biāo)準(zhǔn)其差異不顯著時，則可認(rèn)為這些方法都具有較好的準(zhǔn)確度。所得結(jié)果呈現(xiàn)顯著性差異，則應(yīng)以被公認(rèn)的可靠方法為準(zhǔn)。檢驗兩結(jié)果是否存在顯著性差異的方法有t值檢驗法、En值法。

1)t值檢驗法

雙整體t檢驗(獨立樣本)是檢驗兩個樣本平均數(shù)與其各自所代表的總體差異是否顯著。首先按照F檢驗法檢驗兩樣品的方差是否存在顯著性差異，如無，方可進(jìn)行t值檢驗。

(1)F值檢驗法

本方法主要用來評價兩組數(shù)據(jù)的精密度是否存在顯著性差異。

計算步驟：

a.分別計算甲、乙兩組數(shù)據(jù)的方差(S1)2、(S2)2； b.然后根據(jù)F=(S1)2/(S2)2，計算F值；

注：S1應(yīng)大于S2。

c.查F分布表，F(xiàn)0.05，(n1，n2)

d.F小于F0.05，說明兩組數(shù)據(jù)的精密度無顯著差異。

(2)檢驗統(tǒng)計量為式(5)：

(5)

其中，

S為兩樣品標(biāo)準(zhǔn)偏差;

n為樣本的個數(shù)。

以0.05為顯著性水平，f=n1+n2-2，查t值表，得臨界值t表。如t

2)En法

當(dāng)實驗室能夠?qū)蓚€檢測項目進(jìn)行正確的不確定度評定時，可使用En值對結(jié)果評價。本方法還適用于利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行驗證、已知不確定度的兩個實驗室間的比對和留樣再測情況。

計算公式(6)：

(6)

其中，x1是一種方法的測量結(jié)果，x2是另一種方法的測量結(jié)果，U1是一種方法的實驗室擴(kuò)展不確定度。U2是另一種方法的實驗室擴(kuò)展不確定度。

注：①如進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)驗證、實驗室間比對、留樣再測時，則可將x2改成被測物品參考值、另一個實驗室的或上次的測量結(jié)果，將U2改成參考值的擴(kuò)展不確定度、另一個實驗室或本實驗室的擴(kuò)展不確定度。

②用于實驗室間比對時，當(dāng)已知參比實驗室的不確定度優(yōu)于本實驗室，且無法獲取具體不確定度值時，可保守認(rèn)為與本實驗室該結(jié)果的不確定度相等。

③如利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行驗證，可假定本實驗室測量結(jié)果的不確定度等同于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書上給定的不確定度，以簡化計算公式。

判定方式：

如En≤1，則表明實驗室的結(jié)果滿意，否則為不滿意。

準(zhǔn)確度可采用2.6.1—2.6.3中的一種或多種合適的方法進(jìn)行，匯總情況見表7。

表7 準(zhǔn)確度試驗及判定方式匯總表

3 結(jié)論

檢測方法的驗證和確認(rèn)是確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性非常重要的環(huán)節(jié)，也是實驗室必做的工作之一。只有做好方法的驗證和確認(rèn)才能確保實驗室具有使用新方法進(jìn)行檢測的技術(shù)能力。但目前如何進(jìn)行方法驗證和確認(rèn)卻沒有統(tǒng)一的做法。本文根據(jù)實驗室的操作經(jīng)驗和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，闡述了如何進(jìn)行新引進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)方法的驗證和非標(biāo)方法的確認(rèn)，旨在為廣大化學(xué)分析實驗室提供一種切實可行的工作方法，確保實驗室出具的分析結(jié)果科學(xué)、準(zhǔn)確、可靠。