氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定土壤中多類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物

丁 皓 吳小東 李長于

(1 浙江省環(huán)境保護科學設計研究院， 杭州 310007；2 浙江方圓檢測集團股份有限公司，杭州 310018)

前言

1996年，歐洲委員會給出了內(nèi)分泌干擾物的第一個定義：“改變生物體或其后代或(亞)人群內(nèi)分泌系統(tǒng)功能的外源物質(zhì)或混合物”。許多以不同化學結(jié)構為特征的天然和合成(或半合成)試劑具有破壞調(diào)節(jié)細胞生長，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和發(fā)育的正常內(nèi)分泌過程的潛力[1]。美國環(huán)保局1998年公布了67類危及人體和其他生物體的內(nèi)分泌干擾物名單，這些化合物存在約86 000種商用化學品中，人群接觸幾率極大，此類物質(zhì)在環(huán)境中存在時間長，并且只要極少量便會起到擾亂生物體內(nèi)分泌的作用，造成免疫缺陷、異常生長發(fā)育、甚至長達多代的危害等各類疾病。目前，與廢棄物污染相關的內(nèi)分泌干擾物主要有鄰苯二甲酸酯類[2-6]、己二酸酯類[7-10]、鹵代聯(lián)苯[11-13]和烷基酚類[14-17]等。

對內(nèi)分泌干擾物進行及時準確檢測，能有效預防環(huán)境中的內(nèi)分泌干擾物造成的危害，是對內(nèi)分泌干擾物進行預防和治理的關鍵步驟。目前較為常用的快速處理環(huán)境樣品的萃取技術有：索氏提取、固相萃取、固相微萃取、超聲波萃取、微波萃取、加速溶劑萃取和超臨界流體萃取等。主要用到的檢測方法為氣相色譜法(GC)[18]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[9,19]、高效液相色譜法(HPLC)[20-21]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)[22]。

就目前而言，國內(nèi)的檢測方法主要針對食品以及日用品等方面，并未充分重視對排放到環(huán)境中干擾物的檢測，而且相比較于食品及日用品中內(nèi)分泌干擾物較為單一的特點，排放到環(huán)境中的內(nèi)分泌干擾物質(zhì)種類多樣，濃度低且來源廣，只針對某一種內(nèi)分泌干擾物的分析手段，在日趨復雜的環(huán)境檢測任務中無法起到很好作用。在已報道針對水體和土壤的檢測方法中，多集中于單獨檢測一類內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，工作重復量大，耗時長且成本較高，應用于實際工作可行性不高，且內(nèi)分泌干擾物在環(huán)境中的濃度較低即可導致危害的特點，相對應的分析手段通常需要較低的檢出限。因此，開發(fā)出能對多類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物同時進行高效分析的檢測方案，能有效避免上述缺陷，有利于對檢測的規(guī)?；ぷ?。

綜上所述，若能開發(fā)合適的前處理技術，配合高效檢測手段，開發(fā)對多種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物進行同時檢測將極大有助于檢測效率的提高，使之適合于環(huán)境相關的監(jiān)測工作。

1 實驗部分

1.1 儀器及材料

實驗過程中所用到的儀器如表1所示，試劑及標準物質(zhì)見表2。

表1 實驗儀器

表2 實驗試劑及標準物質(zhì)

1.2 樣品制備與前處理

將土壤樣品放于常壓下干燥，過0.25 mm孔徑篩去除石塊、植物根莖和其它較大顆粒，經(jīng)粉碎機研磨，過0.12 mm孔徑篩，保存于干燥器中待測。

稱取制備好的土壤樣品1.0 g于玻璃比色管中，加入0.01 mL內(nèi)標標準中間溶液(濃度為10 mg/L)和10 mL丙酮(50%)+正己烷(50%)混合溶劑(分兩次加入)，每次超聲提取20 min，經(jīng)離心后，合并提取液，用氮吹儀在40 ℃下吹至近干，準確加入1.0 mL正己烷定容，渦漩，作為待凈化液。選用硅膠固相萃取柱(事先用10 mL正己烷活化)進行凈化，將凈化液過柱，待自然流干后，用10 mL洗脫液[二氯甲烷(90%)+丙酮(10%)]進行洗脫，收集洗脫液，用氮吹儀在40 ℃下吹至近干，加入1.0 mL正己烷定容，渦漩，過0.22 μm濾膜，上機測定。

1.3 儀器工作條件

1.3.1色譜條件

色譜柱：HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)毛細管色譜柱；載氣：氦氣，純度≥99.999%；進樣口溫度280 ℃；柱溫條件：60 ℃保持1 min，以10 ℃/min的速率升溫至220 ℃，保持1 min，以5 ℃/min的速率升溫至280 ℃，保持8 min；流速1.0 mL/min；進樣方式為不分流；進樣體積1 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件

電離方式為EI；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；測定模式為全掃描(Fullscan)和選擇離子監(jiān)測(SIM)，質(zhì)量掃描范圍10～550 amu。

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)分泌干擾物的色譜分離

根據(jù)查閱的文獻資料，鄰苯二甲酸酯類、己二酸酯類、烷基酚類和多氯聯(lián)苯類內(nèi)分泌干擾物均可在非極性毛細管色譜柱得到較好分離。由于本實驗涉及檢測組份數(shù)目較多，且種類不同，為了保證一次能夠分離多種物質(zhì)，需要對儀器的條件參數(shù)進行調(diào)整。

實驗中將配制的41種標準物質(zhì)混合溶液，通過GC/MS全掃描和選擇離子監(jiān)測(SIM)獲得41種目標化合物的總離子流色譜圖(圖1)及對應的質(zhì)譜圖，然后選擇豐度高、干擾低的特征離子作為SIM(選擇離子監(jiān)測)定量離子，同時選擇豐度較高、干擾較低的2～3種特征離子作為定性離子，通過對定性離子豐度比例的分析實現(xiàn)對目標化合物的定性，按此方法35 min內(nèi)可完成41種目標化合物的分析測定。

由圖1可以看出，在此操作條件下，待測的41種物質(zhì)能較好地分離，其分離效果較好，能夠在不同保留時間下出峰，故該操作條件可行。

圖1 41種標準物質(zhì)總離子流色譜圖Figure 1 Total ion chromatogram of 41 standard substances.

2.2 提取方式的選擇

振蕩提取、索氏提取等傳統(tǒng)的提取方法處理周期長、溶劑消耗量大。微波輔助提取、加速溶劑提取、超臨界流體提取等儀器和技術成本相對較高。超聲波提取法不僅能有效地將結(jié)構穩(wěn)定的有機物從固體樣品中提取出來，且具有效率高、儀器價格便宜、操作簡單等優(yōu)點。綜合考慮，本研究選擇超聲波提取法提取土壤或底泥中這四類內(nèi)分泌干擾物。

2.3 不同提取溶劑提取率的比較

取3份相同土壤樣品1.0 g(精確至0.000 1 g)，加入10 mg/L的40種內(nèi)分泌干擾物標準中間溶液0.1 mL，分別加入二氯甲烷、正己烷、丙酮(50%)+正己烷(50%)混合溶劑10 mL對土壤樣品進行超聲提取30 min，然后經(jīng)離心，過濾膜上機測試。結(jié)果表明：二氯甲烷、丙酮(50%)+正己烷(50%)混合溶劑提取效果較好；正己烷提取效率除氯代聯(lián)苯較好外，鄰苯二甲酸酯、烷基酚和己二酸酯提取效率較差，回收率基本都在50%以下。研究發(fā)現(xiàn)，使用添加了丙酮的正已烷-丙酮(1∶1，V/V)混合溶劑體系對目標化合物提取效率較高，為測定土壤中內(nèi)分泌干擾物的最佳提取溶劑。

2.4 超聲提取時間的選擇

圖2 不同提取時間下內(nèi)分泌干擾物峰面積-1Figure 2 Peak area of endocrine disruptor under different extraction times-1.

以丙酮(50%)+正己烷(50%)混合溶劑為提取溶劑時，考察5、10、20、30 min 4種不同的超聲時間下樣品提取率，確定最優(yōu)提取時間(圖2—5)。實驗結(jié)果表明，隨著超聲時間的增加，目標化合物的提取率有所提高，在20、30 min超聲時間下提取效果較好，同時，由于30 min的超聲提取時間對目標化合物提取效率整體上有下降趨勢，考慮目標化合物提取率及實驗效率等因素，最終確定超聲時間為20 min。

圖3 不同提取時間下內(nèi)分泌干擾物峰面積-2Figure 3 Peak area of endocrine disruptor under different extraction times-2.

圖4 不同提取時間下內(nèi)分泌干擾物峰面積-3Figure 4 Peak area of endocrine disruptor under different extraction times-3.

圖5 不同提取時間下內(nèi)分泌干擾物峰面積-4Figure 5 Peak area of endocrine disruptor under different extraction times-4.

2.5 固相提取柱凈化效果及洗脫溶劑比較

對硅膠柱、C18柱和弗羅里硅土柱(Florisil小柱)進行洗脫對比實驗。實驗過程稱取相同陰性土壤樣品1 g(精確至0.000 1 g)，并加入10 mg/L的40種混合標準溶液0.1 mL，按土壤樣品前處理步驟進行，得到待凈化液，按照正交實驗步驟，分別對硅膠柱、C18柱和弗羅里硅土柱三種固相萃取柱凈化效果，以及正己烷、二氯甲烷、二氯甲烷∶丙酮(9∶1，V/V)三種洗脫溶劑洗脫效果進行正交實驗分析。 結(jié)果顯示無論選用哪種提取柱時，三種洗脫溶劑的總體效果皆為二氯甲烷∶丙酮(9∶1，V/V)最佳。當用二氯甲烷∶丙酮(9∶1，V/V)混合溶液作為洗脫溶劑，比較硅膠柱、C18柱和弗羅里硅土柱的凈化效果，其中硅膠柱的回收率較高，基質(zhì)干擾較少，凈化效果最好，因此本實驗采用硅膠柱凈化。

2.6 標準曲線及檢出限

分別對40種內(nèi)分泌干擾物標準工作系列溶液(0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.0、2.0 mg/L)進行測定，通過內(nèi)標法，以40種內(nèi)分泌干擾物定量離子與內(nèi)標物二(1-丁基戊烷)己二酸定量離子峰面積比y對其濃度比x進行線性回歸。結(jié)果顯示，在0.01～2.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，所得峰面積比與濃度比的線性關系良好，線性回歸方程和相關系數(shù)(R2)如表3所示。稱取陰性空白樣品，加入40種內(nèi)分泌干擾物標準工作溶液，上機測試得出信噪比，以3倍信噪比(S/N=3)得出該方法檢出限，結(jié)果如表3所示。

表3 40種內(nèi)分泌干擾物線性回歸方程及相關系數(shù)(R2)

2.7 方法加標回收及精密度實驗

稱取1 g(精確至0.000 1 g)空白樣品于10 mL比色管中，按低、中、高三個水平分別加入1 mg/L的40種內(nèi)分泌干擾物混合標準溶液0.02、0.1、1.0 mL，每個水平做6個平行實驗，然后按照樣品前處理步驟進行實驗，經(jīng)上機得出對應的回收率(表4)。

表4 精密度和加標回收實驗結(jié)果

2.8 實際樣品分析

利用本實驗建立的方法，將采集來的30份土壤樣品進行了檢測，根據(jù)保留時間和離子比率定性，內(nèi)標法定量，結(jié)果表明，在所選取的土樣中，鄰苯二甲酸二異丁酯(DIBP)，鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)與鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)等常見的鄰苯二甲酸酯類均有檢出(表5)。陽性樣品的色譜圖如圖6所示。

表5 樣品檢測結(jié)果

圖6 陽性樣品總離子流色譜圖Figure 6 Total ion chromatogram of positive samples.

3 結(jié)論

內(nèi)分泌干擾物的測定多集中于單獨測定一類物質(zhì)，工作重復量大，耗時長且成本較高，應用于實際工作可行性不高。

采用超聲提取方法，對土壤中的目標物質(zhì)進行提取，并通過固相萃取技術將土壤中低濃度的待測組分富集和凈化，通過考察不同預處理手段對環(huán)境內(nèi)分泌干擾物回收率的影響，最終確定樣品的最佳處理條件為：以丙酮(50%)+正己烷(50%)混合溶劑為提取劑，硅膠固相萃取柱為富集凈化柱，二氯甲烷(90%)+丙酮(10%)混合溶劑為洗脫溶劑，建立了對土壤內(nèi)分泌干擾物多種物質(zhì)同時進行測定的方法，該方法操作簡便快捷，前處理所需設備及試劑較少，線性相關性好，準確度高，檢出限低，具有較高的實用價值，可應用于大批量的樣品檢測，提高環(huán)境監(jiān)測效率。