農(nóng)藥原藥全組分分析雜質(zhì)結(jié)構(gòu)剖析

曹立冬，吳進(jìn)龍，張宏軍，李鳳敏，黃啟良*

(1.生物性危害因子控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，北京 100193；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，北京 100125)

農(nóng)藥原藥全組分分析是指針對(duì)有效成分、含量達(dá)到0.1%及以上的任何雜質(zhì)以及FAO、WHO或者是各國(guó)農(nóng)藥主管部門規(guī)定的任何含量水平的相關(guān)雜質(zhì)(即對(duì)人類和環(huán)境具有明顯的毒害，或者對(duì)使用作物產(chǎn)生藥害，或引起農(nóng)產(chǎn)品污染，或影響農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性，或引起其他不良影響的雜質(zhì))的定性和定量分析，鑒定出的組分總的質(zhì)量含量一般須在98%～102%之間[1]。農(nóng)藥登記資料一般需提供至少5個(gè)批次具有代表性的工業(yè)化生產(chǎn)原藥的全組分分析報(bào)告，所以原藥全組分分析又稱5批次全分析。農(nóng)藥全分析資料是進(jìn)行國(guó)內(nèi)外農(nóng)藥登記及市場(chǎng)開發(fā)不可或缺的重要技術(shù)資料。對(duì)新農(nóng)藥而言，全分析報(bào)告是進(jìn)一步對(duì)其安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)的重要化學(xué)依據(jù)；對(duì)于申請(qǐng)相同產(chǎn)品登記而言，全分析報(bào)告是認(rèn)定其是否與已登記原藥“等同”的重要依據(jù)。

原藥全組分分析最有技術(shù)含量且最有挑戰(zhàn)性的工作是含量>0.1%的雜質(zhì)的定性鑒定。原藥中的雜質(zhì)可以比作是原藥的“指紋”，是判斷原藥合成工藝的重要參數(shù)，也是相同產(chǎn)品認(rèn)定的關(guān)鍵要素。作者根據(jù)近年來從事原藥全分析的經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合實(shí)例分析，談?wù)勗幹须s質(zhì)結(jié)構(gòu)剖析的一些思路和方法。

1 原藥中雜質(zhì)來源

原藥中的雜質(zhì)主要來自于反應(yīng)原料(原料、原料中雜質(zhì)和溶劑)、中間體和副反應(yīng)產(chǎn)物。副反應(yīng)主要包括降解、異構(gòu)化、水(溶劑)解、氧化反應(yīng)、過度取代、重排等反應(yīng)。在眾多來源中，原藥合成所用的原料及合成中間體是最容易判斷且標(biāo)準(zhǔn)品易得的，原藥生產(chǎn)企業(yè)基本上都有每步反應(yīng)的中間體保留且存檔。原料中的雜質(zhì)比較難以推斷的，需要對(duì)原料進(jìn)行定性分析從而判斷其在原藥中的結(jié)構(gòu)。原藥中最常見的雜質(zhì)來自于副反應(yīng)，包括以上提到的各種類型的反應(yīng)。因此，快速準(zhǔn)確的進(jìn)行原藥中雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)推斷，需要具有豐富的有機(jī)化學(xué)反應(yīng)理論和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

2 原藥中雜質(zhì)結(jié)構(gòu)剖析的一般思路

對(duì)于原藥全分析，首先要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)分析確定含量≥0.1%的雜質(zhì)個(gè)數(shù)，一般借助于液相色譜或者氣相色譜分析，通過峰面積百分比進(jìn)行雜質(zhì)個(gè)數(shù)的確定。對(duì)于液相色譜，有效成分和雜質(zhì)的色譜響應(yīng)與所選擇的檢測(cè)波長(zhǎng)緊密相關(guān)，如果僅僅選擇最適合有效成分的波長(zhǎng)，則有些雜質(zhì)可能會(huì)因該波長(zhǎng)下響應(yīng)弱，出現(xiàn)峰面積百分比<0.1%或者沒有色譜響應(yīng)。因此，為了準(zhǔn)確進(jìn)行雜質(zhì)個(gè)數(shù)的判斷，建議選擇3D掃描模式進(jìn)行原藥預(yù)分析。圖1為噻苯隆原藥3D掃描模式下的色譜圖，可以清晰的看出每個(gè)雜質(zhì)組份在每個(gè)波長(zhǎng)下的色譜響應(yīng)情況。

圖1 噻苯隆原藥色譜圖(3D掃描模式)

色譜確定好雜質(zhì)個(gè)數(shù)后，進(jìn)行質(zhì)譜分析，根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)合合成工藝，推斷雜質(zhì)可能的結(jié)構(gòu)。質(zhì)譜分析也可以進(jìn)行雜質(zhì)數(shù)量的確定，有的雜質(zhì)色譜響應(yīng)很弱，卻具有很強(qiáng)的質(zhì)譜響應(yīng)，這點(diǎn)也需要在全分析過程中引起足夠的重視。對(duì)于結(jié)構(gòu)比較確定的雜質(zhì)，如果合成步驟簡(jiǎn)單就通過合成獲取雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，或者直接進(jìn)行購(gòu)買商品化標(biāo)準(zhǔn)品。對(duì)于含量較高，且與有效成分及其它雜質(zhì)分離度較高雜質(zhì)，根據(jù)質(zhì)譜信息難以推斷出合理的化學(xué)結(jié)構(gòu)，通過液相制備色譜進(jìn)行富集，然后結(jié)構(gòu)鑒定。對(duì)于含量很低的雜質(zhì)，可以先通過重結(jié)晶原藥，提高雜質(zhì)含量，母液進(jìn)行液相色譜制備。雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品獲得后，通過與原藥中雜質(zhì)色譜保留時(shí)間(液相還需要比對(duì)紫外吸收光譜圖)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)的比對(duì)，進(jìn)行雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的定性確定。

3 原藥中雜質(zhì)結(jié)構(gòu)剖析實(shí)例分析

3.1 利用核磁裂分和偶合常數(shù)進(jìn)行異構(gòu)體結(jié)構(gòu)鑒定 對(duì)于同分異構(gòu)體，僅僅通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)難以準(zhǔn)確進(jìn)行結(jié)構(gòu)判斷，利用核磁裂分和偶合常數(shù)可進(jìn)行異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)鑒定。氰氟草酯原藥通過質(zhì)譜解析，發(fā)現(xiàn)存在一個(gè)同分異構(gòu)體雜質(zhì)，推斷可能的結(jié)構(gòu)，進(jìn)行定向合成。由于親核取代反應(yīng)的選擇性，得到2個(gè)同分異構(gòu)體1和2(圖2)?；衔?和2由于極性接近，難以通過常規(guī)的柱層析分離，我們借助于液相制備色譜進(jìn)行分離，然后分別進(jìn)行核磁共振氫譜(1H NMR)測(cè)定。借助于核磁裂分和偶合常數(shù)進(jìn)行異構(gòu)體結(jié)構(gòu)鑒定(圖3)，通過色譜保留時(shí)間比對(duì)分析，確定氰氟草酯原藥中存在的同分異構(gòu)體雜質(zhì)為化合物2。

圖2 氰氟草酯同分異構(gòu)體雜質(zhì)合成路線

圖3 氰氟草酯同分異構(gòu)體雜質(zhì)21H NMR譜圖

在氟磺胺草醚原藥全分析中，通過質(zhì)譜解析，發(fā)現(xiàn)存在一個(gè)雙硝基化的雜質(zhì)，由于硝基可能存在芳環(huán)不同的位置，給結(jié)構(gòu)鑒定帶來了困難。我們根據(jù)合成工藝及可能的反應(yīng)位點(diǎn)，推斷可能的雙硝基化雜質(zhì)，進(jìn)行定向合成，得到2個(gè)雙硝基化雜質(zhì)3和4(圖

4)，然后分別進(jìn)行核磁共振氫譜(1H NMR)測(cè)定。借助于核磁裂分和偶合常數(shù)進(jìn)行異構(gòu)體結(jié)構(gòu)鑒定(圖5)，通過色譜保留時(shí)間比對(duì)分析，確定氟磺胺草醚原藥中存在的雙硝基化雜質(zhì)為化合物3。

圖4 氟磺胺草醚原藥雙硝基化雜質(zhì)合成路線

圖5 氟磺胺草醚原藥雙硝基化雜質(zhì)1H NMR譜圖

3.2 水解副反應(yīng)雜質(zhì)鑒定 原藥有效成分合成工藝中經(jīng)常會(huì)用到水溶液，并且原藥儲(chǔ)存過程中也很容易接觸到空氣中的水分子，從而發(fā)生水解反應(yīng)。水解產(chǎn)物是常見的一種副反應(yīng)雜質(zhì)，該類雜質(zhì)也非常容易制備，原藥在適當(dāng)?shù)臈l件進(jìn)行水解反應(yīng)可大量制備水解產(chǎn)物。以氰氟蟲腙和螺蟲乙酯為例，水解產(chǎn)物5和6可以方便的通過一步反應(yīng)制備(圖6)，反應(yīng)后經(jīng)過簡(jiǎn)單的過濾和重結(jié)晶即可得到高純度水解產(chǎn)物。

圖6 氰氟蟲腙和螺蟲乙酯水解產(chǎn)物5和6合成路線圖

3.3 有機(jī)溶劑參與副反應(yīng)雜質(zhì)鑒定 原藥在合成工藝過程會(huì)經(jīng)常用到有機(jī)溶劑，原藥全分析也會(huì)用到有機(jī)溶劑溶解。如果有機(jī)溶劑參與反應(yīng)，就會(huì)發(fā)生溶劑解反應(yīng)，從而帶來新的雜質(zhì)。在做異菌脲全分析過程中，配制異菌脲溶液最初選擇的是甲醇，發(fā)現(xiàn)有新的色譜峰出現(xiàn)，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，該色譜峰峰面積逐漸增加，通過液質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)該化合物為異菌脲的同分異構(gòu)體7(圖7)，甲醇作為親核試劑進(jìn)攻異菌脲導(dǎo)致開環(huán)異構(gòu)化(圖8)[2]。

圖7 異菌脲甲醇異構(gòu)化反應(yīng)

圖8 異菌脲甲醇異構(gòu)化反應(yīng)可能的機(jī)理

吡唑醚菌酯原藥中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)荷比為435的雜質(zhì)，結(jié)合原藥合成工藝，我們推斷是原藥合成最后一步的中間體與反應(yīng)溶劑1，2-二氯乙烷進(jìn)行親核取代反應(yīng)帶來的雜質(zhì)8(圖9)。

圖9 吡唑醚菌酯原藥中質(zhì)荷比為435雜質(zhì)生成途徑

3.4 多(少)鹵(氟、氯、溴)代副反應(yīng)雜質(zhì)鑒定 鹵素(氟、氯、溴)廣泛存在于農(nóng)藥分子中，在鹵代反應(yīng)過程中經(jīng)常出現(xiàn)多(少)鹵代雜質(zhì)出現(xiàn)，鹵素原子的個(gè)數(shù)可以通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)中[M+4]：[M+2]：[M]的豐度比判斷。在苯嗪草酮原藥全分析中，通過質(zhì)譜解析，發(fā)現(xiàn)多一個(gè)氯原子的雜質(zhì)，結(jié)合合成工藝，我們推斷可能的雜質(zhì)為苯環(huán)上氯原子對(duì)位取代，并設(shè)計(jì)了該雜質(zhì)(化合物9)的合成路線(圖10)。非常幸運(yùn)的是，我們合成的雜質(zhì)正好是原藥中存在的雜質(zhì)，該雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)也經(jīng)過了1H NMR確證(圖11)。

圖10 苯嗪草酮原藥中氯代雜質(zhì)合成路線

圖11 苯嗪草酮原藥中氯代雜質(zhì)1H NMR譜圖

吡唑醚菌酯原藥中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)荷比為465的雜質(zhì)，根據(jù)同位素相對(duì)豐度，推斷該雜質(zhì)為吡唑醚菌酯多一個(gè)溴原子。結(jié)合原藥合成工藝，我們推斷可能是吡唑醚菌酯的吡唑環(huán)與溴發(fā)生了溴代反應(yīng)，生成溴代雜質(zhì)10(圖12)，為進(jìn)一步驗(yàn)證該雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，我們一步合成了該溴代雜質(zhì)，并與原藥中的雜質(zhì)進(jìn)行了比對(duì)確認(rèn)。

圖12 吡唑醚菌酯原藥中溴代雜質(zhì)合成路線

3.5 不完全(過度)氧化(還原)反應(yīng)雜質(zhì)鑒定 氧化還原反應(yīng)是農(nóng)藥合成工藝中非常常見的反應(yīng)，不完全(過度)氧化(還原)會(huì)帶來副產(chǎn)物。吡唑醚菌酯原藥中出現(xiàn)質(zhì)荷比為610的雜質(zhì)，按照正常的雜質(zhì)推斷思路，非常難以解析。仔細(xì)分析原藥合成工藝，發(fā)現(xiàn)中間體存在一步硝基還原反應(yīng)，理想的中間體產(chǎn)物應(yīng)該為羥胺，如果硝基還原不完全則會(huì)生成亞硝基，羥胺與亞硝胺進(jìn)行加成反應(yīng)并消除一分子水，則生成質(zhì)荷比為610的雜質(zhì)11(圖13)。乙蟲腈由硫醚氧化得到，過度氧化會(huì)生成雜質(zhì)12(圖14)。

圖13 吡唑醚菌酯原藥中質(zhì)荷比為610雜質(zhì)生成途徑

圖14 乙蟲腈過度氧化雜質(zhì)生成途徑

3.6 重排反應(yīng)雜質(zhì)鑒定 化合物在某些特定的條件下會(huì)發(fā)生重排異構(gòu)化或者重排消除反應(yīng)，從而導(dǎo)致雜質(zhì)的生成。魚藤酮環(huán)外雙鍵會(huì)發(fā)生重排異構(gòu)化反應(yīng)得到熱力學(xué)更穩(wěn)定的環(huán)內(nèi)雙鍵異構(gòu)體13(圖15)。啶嘧磺隆原藥會(huì)發(fā)生重排消除反應(yīng)得到雜質(zhì)14，進(jìn)一步發(fā)生水解反應(yīng)可得到雜質(zhì)15(圖16)。

3.7 特殊反應(yīng)雜質(zhì)鑒定 有機(jī)化學(xué)反應(yīng)類型眾多，有一些不太常見，我們可稱之為特殊反應(yīng)。比如在稻瘟靈原藥全分析過程中，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)結(jié)構(gòu)高度對(duì)稱的雜質(zhì)16，結(jié)合合成工藝，我們推斷有硫代二烯酮中間體生成，發(fā)生[2+2]環(huán)加成反應(yīng)即可得到雜質(zhì)16(圖17)。該雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步經(jīng)過了1H NMR確證(圖18)。

圖15 魚藤酮環(huán)外雙鍵異構(gòu)化

圖16 啶嘧磺隆重排消除反應(yīng)途徑

圖18 稻瘟靈原藥中雜質(zhì)16 1H NMR譜圖

4 結(jié)論

原藥中雜質(zhì)制備主要通過定向合成和液相制備色譜富集；雜質(zhì)純化主要有柱層析、重結(jié)晶、液相制備色譜等三種途徑；雜質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定主要通過核磁、紅外、質(zhì)譜和高分辨質(zhì)譜進(jìn)行。以上介紹的副反應(yīng)類型僅僅是筆者在全分析工作過程中經(jīng)常遇到的反應(yīng)類型，實(shí)際上原藥的品種繁多，可能涉及的副反應(yīng)類型更多，雜質(zhì)結(jié)構(gòu)剖析也會(huì)遇到更大的挑戰(zhàn)。通過上述介紹不難看出，原藥中雜質(zhì)結(jié)構(gòu)剖析是一項(xiàng)難度很大的工作，不僅需要分析化學(xué)的技術(shù)，更需要具備豐富的有機(jī)化學(xué)的反應(yīng)理論和有機(jī)合成的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。