藏藥香蕓火絨草化學成分及抗菌活性研究

徐云玲，祝汪洋，譚靜玲，張 浩

1湖北四環(huán)制藥有限公司，武漢 430056；2湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院，武漢430075

香蕓火絨草(LeontopodiumhaplophylloidesHand.-Mazz.)系菊科火絨草屬多年生草本植物，在我國主要分布于青海東部地區(qū)、四川西部和北部、甘肅西南部[1]，為當?shù)夭刈宄Ｓ盟?，具有清熱、涼血、消炎、利尿等功效。其化學成分主要包括苯丙素類、黃酮及揮發(fā)油類[2]。有文獻記載香蕓火絨草揮發(fā)性成分對病原真菌具有明顯的抑制作用[2-3]。為更好地開發(fā)利用該藥用資源，本實驗對該植物地上部分進行了系統(tǒng)的化學成分研究和抑菌效應評價實驗，從藥理活性較高的二氯甲烷和乙酸乙酯部位進行化學成分研究，從中分離得到17個化合物，經理化性質及波譜分析分別鑒定為咖啡酸(caffeic acid，1)、咖啡酸-β-苯乙醇酯(phenethyl caffeate，2)、原兒茶酸(protocatechuic acid，3)、tyrosol(4)、對羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid，5)、鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，6)、異莨菪亭(isoscopoletin，7)、7-(2,3-epoxy-3-methyl-3-butyloxy)-6-methoxycoumarin(8)、洋芹素(apigenin，9)、牡荊素(vitexin，10)、5-羥基-4′,7-二甲氧基-6,8-二甲基黃酮(5-hydroxy-4′，7-dimethoxy-6，8-dimethyl flavones，11)、5，7-二羥基-8-甲氧基黃酮(5,7-dihydroxy-8-methoxyflavone，12)、百蕊草素Ⅲ(kaempferol 3-glucorhamnoside，13)、methyl flavogallonate(14)、3,5,7,3′,4′-pentahydroxyflavone(15)、木犀草素(luteolin，16)、高良姜素(galangin，17)?；?～16為首次從該植物中分離得到。

1 儀器與材料

Varian UNITYINOVA-600型超導核磁共振儀(美國瓦里安公司)；Agilent 1260型高效液相色譜儀、Agilent Eclipse XDB-C18分析色譜柱(250 mm ×4.6 mm,5 μm)(美國Agilent公司)； EYELA SB-1000型旋轉蒸發(fā)儀(日本EYALA公司)；JP-020型臺式實驗室用超聲波清洗器(深圳市潔盟清洗設備有限公司)；ODS RP-18 (40～60 μm)柱色譜填料和RP-18 F254薄層預制板(美國Merck 公司)；柱色譜硅膠(200～300 目)及薄層色譜硅膠G(青島海洋化工廠)；硅膠 GF254薄層預制板(煙臺化學工業(yè)研究所)；Sephadex LH-20柱色譜凝膠(瑞典Amersham Biosciences公司)；液相色譜試劑甲醇、乙腈為市售色譜純，其它所用試劑均為市售分析純。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢菌均購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

本實驗中所用香蕓火絨草藥材采于四川甘孜州道孚境內，由陳敬炳(研究員，湖北省中醫(yī)院)主任藥師鑒定為菊科火絨草屬植物香蕓火絨草LeontopodiumhaplophylloidesHand.-Mazz。

2 提取與分離

取香蕓火絨草地上部分12 kg，粉碎，用75%乙醇浸泡，加熱回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮， 得棕黑色浸膏。浸膏用水分散后依次用等體積二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇反復多次萃取。萃取液減壓濃縮得氯仿部位 140 g、乙酸乙酯部位87 g、正丁醇部位68 g。其中乙酸乙酯部位和正丁醇部位分別經反復硅膠柱色譜、 Sephadex LH-20 純化，分離得到化合物7(6.3 mg)、8(7.8 mg)、9(9.7 mg)、10(8.3 mg)、11(6.9 mg)、12(7.1 mg)、13(22.6 mg)、14(5.8 mg)、15(7.9 mg)、16(16.8 mg)、17(32.5 mg)。運用制備薄層色譜、重結晶等方法從二氯甲烷部位分離得到化合物1(14.5 mg)、2(6.2 mg)、3(15.0 mg)、4(13.4 mg)、5(8.5 mg)、6(17.5 mg)。

3 結構鑒定

化合物1橘黃色顆粒狀固體(丙酮);1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：12.11(lH，brs，1-COOH)，9.51(1H，brs，OH)，9.17(1H，brs，OH)，7.61(1H，d，J=3.6 Hz，H-3)，7.11(1H，d，J=3.0 Hz，H-5)，7.01 (1H，dd，J=9.6，2.4 Hz，H-9)，6.79(1H，d，J=8.4 Hz，H-8)，6.19(1H，d，J=13.2 Hz，H-2)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：167.9(C-1)，148.2(C-6)，145.4(C-7)，144.3(C-3)，125.2(C-4)，119.9(C-9)，115.8(C-8)，114.9(C-2)，114.5(C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻[4]對照基本一致，故確定化合物1為咖啡酸。

化合物2白色晶體(二氯甲烷);1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.73(1H，d，J=15.6 Hz，H-8)，7.51(1H，d，J=16.0 Hz，H-7)，7.41(2H，d，J=6.6 Hz，H-4′，8′)，7.29～7.32(1H，m，H-6′)，7.24-7.27(2H，m，H-5′，7′)，7.17(1H，d，J=3.0 Hz，H-2)，7.13(1H，dd，J=3.6，9.0 Hz，H-6)，6.98(1H，d，J=9.6 Hz，H-5)，3.12(2H，t，J=7.2 Hz，H-1′)，4.41(2H，t，J=10.8 Hz，H-2′)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：166.9(C-9)，143.9(C-4)，143.1(C-3)，141.6(C-7)，131.9(C-3′)，128.8(C-1)，128.6(C-5′，7′)，125.9(C-6′)，125.7(C-4′，8′)，122.0(C-6)，116.5(C-2)，116.5(C-5，8)，69.3(C-1′)，28.5(C-2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[5]對照基本一致，故確定化合物2為咖啡酸-β-苯乙醇酯。

化合物3白色粉末(甲醇);1H NMR (600 MHz，CD3OD)δ：7.63(1H，s，H-2)，7.50(1H，H-8)，6.82(1H，J=8.1 Hz，H-5)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：123.7(C-1)，117.7(C-2)，148.1(C-3)，152.9(C-4)，114.0(C-5)，123.8(C-6)，170.3(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻[6]對照基本一致，故確定化合物3為原兒茶酸。

化合物4無色針晶(丙酮);1H NMR (600 MHz，CD3OD)δ：7.12(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)，6.70(2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5)，3.78(2H，t，J=7.2，7.2 Hz，H-8)，2.80 (2H，d，J=7.2 Hz，H-7)；13C NMR (150 MHz，CD3OD)δ：131.3(C-1)，131.2(C-2，6)，116.4(C-3，5)，157.1(C-4)，39.7(C-7)，64.8(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]對照基本一致，故確定化合物4為tyrosol。

化合物5無色針晶(甲醇);1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.98(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)，6.92 (2H，d，J=9.0 Hz，H-3，5)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：170.4(C-7)，163.7(C-4)，133.3(C-2，6)，123.0(C-1)，116.3(C-3，5)。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]對照基本一致，故確定化合物5為對羥基苯甲酸。

化合物6無色針晶(二氯甲烷);1H NMR(600 MHz ，Pyr-d5)δ：7.75(2H，dd，J=3.6，2.0 Hz，H-3，6)，7.40(2H，dd，J=2.0，3.6 Hz，H-4，5)，4.25(4H，m，H-7，7′)，1.53(4H，m，H-8，8′)，1.23(4H，m，H-9，9′)，0.74(6H，t，J=7.2 Hz，H-10，10′)；13C NMR(600 MHz ，Pyr-d5)δ：167.9(C-7，7′)，133.2(C-1，2)，131.5(C-4，5)，129.4(C-3，6)，65.7(C-8，8′)，30.9(C-9，9′)，19.5(C-10，10′)，13.9(C-11，11′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]對照基本一致，故確定化合物6為的鄰苯二甲酸二丁酯。

化合物7白色針晶(丙酮);1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.95 (1H，d，J=9.6Hz，H-4)，7.19(1H，s，H-5)，6.85 (1H，s，H-8)，6.30(1H，dd，J=9.6 Hz，H-3)，4.00(3H，s，3-OCH3)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：164.4(C-2)，153.1(C-7)，151.7(C-9)，147.3(C-6)，146.4(C-4)，112.8(C-3)，112.8(C-10)，110.2(C-5)，104.2(C-8)，57.2(C-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]對照基本一致，與異莨菪亭對照品薄層比較，二者的薄層層析行為一致，確定化合物7為異莨菪亭。

化合物8黃色粉末(甲醇)，濃硫酸乙醇試劑反應顯棕褐色;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：9.89(1H，s，6-OH)，6.26(1H，d，J=9.6 Hz，H-3)，7.59(1H，d，J=9.0 Hz，H-4)，6.89(2H，s，H-5)，6.82(2H，s，H-8)，3.65(3H，s，6-OCH3)，4.54～4.70(2H，m，H-1′)，3.62(1H，m，H-2′)，1.43(3H，s，H-4′)，1.42(3H，s，H-5′)；13C NMR (150 MHz，CD3OD)δ：161.4(C-2)，113.5 (C-3)，144.0 (C-4)，109.4 (C-5)，147.0(C-6)，153.7 (C-7)，100.6(C-8)，150.6 (C-9)，112.0(C-10)，56.4(6-OCH3)，68.8(C-1′)，60.8(C-2′)，56.4(C-3′)，25.0(C-4′)，18.3(C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]對照基本一致，故確定化合物8為7-(2，3-epoxy-3-methyl-3-butyloxy)-6-methoxycoumarin。

化合物9淡黃色粉末狀結晶(丙酮)，鹽酸-鎂粉反應呈陽性，Molish反應呈陰性;1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：13.03(1H，s，5-OH)，8.07(2H，s，H-2′，6′)，7.16(2H，d，J=9.0 Hz，H-3′，5′)，6.97(1H，s，H-3)，6.46(1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，6.09(1H，d，J=1.8 Hz，H-6)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：177.9(C-4)，166.1(C-7)，162.9(C-2)，161.0(C-5)，158.7(C-9)，131.1(C-2′，6′)，124.0(C-1′)，116.7(C-3′，5′)，104.9(C-3)，99.8(C-6)，95.0(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]對照基本一致，故確定化合物9為洋芹素。

化合物10黃色粉末(甲醇)。鹽酸-鎂粉反應呈陽性，Molish反應陽性;1H NMR(600 MHz，Pyr-d5)δ：13.83(lH，s，5-OH)，8.32(2H，d，J=9.0 Hz，H-2′，6′)，8.29(2H，d，J=9.6 Hz，H-3′，5′)，6.81(lH，s，H-3)，6.69(1H，s，H-6)，4.83(lH，d，J=12.0 Hz，H-1′′)，3.92(lH，dd，J=12.6，3.0 Hz，H-6′′a)，3.81(lH，dd，J=12.6，7.2 Hz，H-6"b)，3.51(lH，m，H-4′′)，3.49(lH，m，H-5′′)，3.43(lH，m，H-2")，3.29(lH，m，H-3′′);13C NMR (150 MHz，Pyr-d5)δ：182.8(C-4)，164.9(C-2)，162.8(C-5)，162.7(C-4′)，162.5(C-7)，158.0(C-9)，129.8(C-2′，6′)，122.2(C-1′)，116.5(C-3′，5′)，106.0(C-8)，105.8(C-10)，103.0(C-3)，99.5(C-6)，83.3(C-5′′)，81.1(C-3′′)，75.6(C-1′′)，72.9(C-2′′)，72.6(C-4′′)，62.6(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]對照基本一致，故確定化合物10為牡荊素。

化合物11黃色針狀結晶(丙酮)，鹽酸-鎂粉反應呈陽性;1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：13.02(1H，s，5-OH)，8.06(2H，s，H-2′，6′)，7.14(2H，s，H-3′，5′)，6.98(1H，s，H-3)，3.86、3.76(3H，each，-OCH3)，2.10、2.35(3H，each，-CH3)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：182.6(C-4)，163.68(C-7)，162.4(C-4′)，162.1(C-2)，156.3(C-5)，152.37(C-9)，128.3(C-2′，6′)，122.9(C-1′)，114.7(C-3′，5′)，113.1(C-6)，108.7(C-8)，106.5(C-10)，103.5(C-3)，60.3、55.5(4′，7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]對照基本一致，故確定化合物11為5-羥基-4′，7-二甲氧基-6，8-二甲基黃酮。

化合物12黃色針狀結晶(丙酮)，TLC薄層板上噴1%AlCl3-乙醇溶液后置紫外燈下顯鮮黃色熒光;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：12.51(1H，s，5-OH)，10.82(1H，s，7-OH)，6.99(1H，t，J=8.4 Hz，H-4′)，6.31(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：182.0(C-4)，163.0(C-2)，157.4(C-7)，156.2(C-5)，149.6(C-9)，132.0(C-4′)，130.8(C-1′)，129.2(C-3′，5′)，127.8(C-8)，126.2(C-2′，6′)，105.0(C-3)，103.7(C-10)，99.1(C-6)，61.0(8-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]對照基本一致，故確定化合物12為5，7-二羥基-8-甲氧基黃酮。

化合物13黃色針晶(甲醇)，TLC薄層板上噴5%香草醛-濃硫酸噴霧后加熱顯黃色;1H NMR (600 MHz，CD3OD)δ：12.41(1H，s，5-OH)，8.13(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.99(2H，d，J=7.2 Hz，H-3′，5′)，6.48(1H，s，H-8)，6.27(1H，s，H-6);13C NMR (150 MHz，CD3OD)δ：176.9(C-4)，165.3(C-7)，161.7(C-5)，159.3(C-4′)，157.2(C-9)，147.6(C-2)，137.5(C-3)，129.2(C-2′，6′)，123.7(C-1′)，116.4(C-3′，5′)，103.9(C-1′)，99.3(C-6)，94.5(C-8).以上數(shù)據(jù)與文獻[16]對照基本一致，故確定化合物13為百蕊草素Ⅲ。

化合物14淡黃色無定形粉末(甲醇)，鹽酸-鎂粉反應呈陽性;1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.47(1H，s，H-5′)，7.07(1H，s，H-6′′)，3.43(3H，s，OCH3);13C NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ：166.2(C-7′′)，159.0(C-7′)，157.3(C-7)，147.6(C-4′)，146.0(C-4)，144.0(C-5′′)，143.7(C-3′′)，139.2(C-3′)，138.2(C-3)，137.3(C-2′)，136.3(C-2)，135.5(C-4′′)，125.4(C-1′′)，118.8(C-6)，118.2(C-2′′)，112.8(C-1′)，111.5(C-1)，119.9(C-6)，109.1(C-5)，107.5(C-5′)，107.4(C-6′′)，51.3(C-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]對照基本一致，故確定化合物14為methylflavogallonate。

化合物15黃色粉末(甲醇)，鹽酸-鎂粉反應呈陽性，Molish反應為陽性，AlCl3顯色呈黃綠色;1H NMR(600 MHz，Pyr-d5)δ：13.21(1H，s，5-OH)，11.79(2H，s，4′，7-OH)，8.50(1H，d，J=1.8 Hz，3′-OH)，8.00(1H，dd，J=1.8，1.8 Hz，H-2′)，7.28(1H，d，J=8.4 Hz，H-6′)，6.65(1H，d，J=1.8 Hz，H-5′)，6.61(1H，d，J=1.8 Hz，H-8);13C NMR (150 MHz，Pyr-d5)δ：177.4(C-4)，165.6(C-7)，162.6(C-9)，157.6(C-5)，147.9(C-2)，147.2(C-3′，4′)，138.0(C-3)，121.2(C-1′，6′)，116.8(C-2′，5′)，104.6(C-10)，99.33(C-6)，94.40(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]對照基本一致，故確定化合物15為3，5，7，3′，4′-pentahydroxyflavone。

化合物16黃色粉末(甲醇)，TLC薄層板上噴1%AlCl3-乙醇溶液后置紫外燈下顯鮮黃色熒光;1H NMR (600 MHz，Pyr-d5)δ：13.21(1H，s，5-OH)，11.26(2H，m，7-OH)，11.03(1H，m，3′，4′-OH)，7.29(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.69(1H，d，J=1.8 Hz，H-5′)，6.61(1H，s，H-3)，6.49(1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，6.22(1H，m，H-6)；13C NMR (150 MHz，Pyr-d5)δ：179.9(C-4)，165.6(C-7)，165.0(C-2)，162.5(C-9)，157.6(C-5)，150.4(C-4′)，147.2(C-3′)，121.5(C-1′)，121.1(C-6′)，116.8(C-5′)，114.0(C-2′)，104.6(C-10)，103.5(C-3)，99.3(C-6)，94.4(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]對照基本一致，故確定化合物16為木犀草素。

化合物17黃色針晶(丙酮)，鹽酸-鎂粉反應呈陽性;1H NMR (600 MHz，CDCl3)δ：12.25(1H，brs，7-OH)，8.20(2H，d，J=7.8 Hz，H-2′，6′)，7.46～7.55(3H，m，H-3′～5′)，6.53(1H，s，H-6)，6.22(1H，s，H-8)，2.54(2H，s，5，3-OH)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：176.6(C-4)，164.3(C-7)，161.2(C-5)，157.1(C-9)，145.6(C-2)，137.1(C-3)，131.1(C-10)，130.0(C-4′)，128.5(C-2′，6′)，127.6(C-3′，5′)，103.3(C-1′)，98.3(C-6)，93.7(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]對照基本一致，故確定化合物17為高良姜素。

4 結論

本研究從香蕓火絨草中分離鑒定得到17個化合物，包括苯丙素類、黃酮類、香豆素類等成分。針對分離得到的化合物進行抗菌活性篩選。采用培養(yǎng)基打孔法，測定化合物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及蠟狀芽孢菌的抗菌作用，使用處于對數(shù)生長期的菌種，所有樣品均使用丙酮溶解配制成5 mg/mL的藥液。抑菌圈的直徑大小可以用來說明不同化合物的抗菌作用的強弱，以純丙酮為對照。通過測量各抑菌圈直徑，計算抑菌率[抑菌率=對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對照組菌落直徑×100%)]，結果表明化合物1、2、4～6、9、10、13～17對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及蠟狀芽孢桿菌均有抑制作用，其抑制率達到60%以上。該植物中化合物13、16和17含量較大，今后有望利用其植物細胞組織培養(yǎng)或結構修飾，以獲得更多化合物，拓寬該植物的生物活性研究的內容。