基于密碼子優(yōu)化策略的厚殼貽貝幾丁質(zhì)酶原核重組表達(dá)及功能

劉宏漢，侯召東，王恒偉，范美華，王健鑫，廖 智

（1.浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，海洋生物蛋白質(zhì)工程實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)創(chuàng)新應(yīng)用研究院，浙江舟山 316021）

作為地球上最重要的碳源物質(zhì)，幾丁質(zhì)是世界上最豐富的生物大分子之一，對地球的碳循環(huán)以及生態(tài)系統(tǒng)的維持具有極為重要的意義。幾丁質(zhì)酶是催化水解幾丁質(zhì)中β-1，4糖苷鍵的酶，在生物中廣泛存在[1]。根據(jù)幾丁質(zhì)酶的催化特點(diǎn)，可以分為內(nèi)切酶和外切酶兩大類，兩者的催化位點(diǎn)存在差異[2]。不同物種來源的幾丁質(zhì)酶存在明顯的功能多樣性。例如，微生物幾丁質(zhì)酶主要與其細(xì)胞壁合成，營養(yǎng)有關(guān)[3-5]；昆蟲幾丁質(zhì)酶則與昆蟲的發(fā)育以及蛻皮有關(guān)[6]；植物幾丁質(zhì)酶與植物的生長發(fā)育以及免疫有關(guān)[7]；人體中的幾丁質(zhì)酶則被認(rèn)為與免疫防御以及部分疾病有關(guān)[8-12]；因而在臨床上具有重要的研究意義；此外，部分生物的抗菌肽也發(fā)現(xiàn)具有幾丁質(zhì)酶類似結(jié)構(gòu)域，如Tachycitin[13]、Penaeidin[14]等均具有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這也進(jìn)一步證實(shí)了幾丁質(zhì)酶參與了免疫功能。在貝類中，幾丁質(zhì)酶還被發(fā)現(xiàn)與貝殼的形成有關(guān)聯(lián)，屬于貝殼基質(zhì)蛋白的一種，參與了貝殼中幾丁質(zhì)的代謝[15]。這表明在貝類中，幾丁質(zhì)酶也參與了多種生物學(xué)功能，因此，對貝類幾丁質(zhì)酶的研究有助于了解這一分子的分子機(jī)化機(jī)制。

厚殼貽貝Mytilus coruscus是我國重要的養(yǎng)殖貝類，在前期工作中，從厚殼貽貝血清中分離到一種抗菌肽，該抗菌肽分子量為6.3 kDa，序列全長為54個(gè)氨基酸殘基，其序列中含有典型的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，因而命名為mytichitin-CB[17]；該抗菌肽的全長cDNA基因（命名為mytichitin-1）經(jīng)克隆后發(fā)現(xiàn)該基因編碼一段由446個(gè)氨基酸殘基組成的前體蛋白，該前體蛋白與來自其他物種的幾丁質(zhì)酶具有較高的序列相似性[17]；而之前鑒定的抗菌肽mytichitin-CB是該前體蛋白C端55個(gè)殘基的裂解產(chǎn)物。這表明厚殼貽貝幾丁質(zhì)酶mytichitin-1存在體內(nèi)裂解現(xiàn)象，即厚殼貽貝幾丁質(zhì)酶通過將其C端的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域（mytichitin-CB）裂解，并釋放入血液，作為抗菌肽參與厚殼貽貝的免疫防御。這也是首次發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶存在體內(nèi)裂解現(xiàn)象，該現(xiàn)象與魚類組蛋白樣抗菌肽的產(chǎn)生機(jī)制類似[18]。上述結(jié)果表明厚殼貽貝mytichitin可能是一種多功能的幾丁質(zhì)酶，但是由于mytichitin在厚殼貽貝體內(nèi)含量極低，因此很難通過常規(guī)的蛋白質(zhì)分離純化手段獲得天然mytichitin開展研究。重組表達(dá)是獲取蛋白質(zhì)分子的重要手段。目前幾丁質(zhì)酶的重組表達(dá)已先后在大腸桿菌[19]，酵母[20]，昆蟲細(xì)胞[21]，植物[22]等表達(dá)體系中獲得成功。上述表達(dá)體系中，大腸桿菌重組表達(dá)依然是最為成熟的表達(dá)策略，但是面臨的一個(gè)問題就是大腸桿菌存在密碼子偏愛性而導(dǎo)致在表達(dá)真核生物的重組蛋白時(shí)存在效率低下甚至表達(dá)不成功的問題[23-24]。解決這一問題的主要辦法是將目標(biāo)基因的密碼子替換為大腸桿菌偏愛密碼子[25]。為此，采取了密碼子優(yōu)化策略，對厚殼貽貝mytichitin-1基因按照大腸桿菌偏愛密碼子進(jìn)行了重新設(shè)計(jì)和優(yōu)化；進(jìn)一步利用原核重組表達(dá)策略，獲得厚殼貽貝mytichitin-1重組蛋白，在此基礎(chǔ)上，對厚殼貽貝重組mytichitin-1開展了分離純化、鑒定及功能分析。上述研究結(jié)果為后續(xù)幾丁質(zhì)酶的分子改造以及相關(guān)功能機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 厚殼貽貝幾丁質(zhì)酶全酶目標(biāo)基因的設(shè)計(jì)、優(yōu)化與合成

厚殼貽貝幾丁質(zhì)酶mytichitin-1基因全長為1 341 bp，其genebank數(shù)據(jù)庫編號為AHC08445，編碼一個(gè)含有信號肽序列的446個(gè)氨基酸殘基組成的前體蛋白。去除其信號肽序列后，其成熟肽序列基因總長為1 266 bp（含終止密碼子）。根據(jù)厚殼貽貝幾丁質(zhì)酶成熟肽基因序列設(shè)計(jì)表達(dá)目標(biāo)基因，采用大腸桿菌表達(dá)體系開展重組表達(dá)研究。因貽貝為真核生物，因此，采用大腸桿菌偏愛密碼子替代目標(biāo)基因中的部分密碼子；同時(shí)，結(jié)合pET-28a表達(dá)質(zhì)粒的序列特征和插入位點(diǎn)，在目標(biāo)基因的兩端設(shè)計(jì)并添加了酶切位點(diǎn)和六聚His標(biāo)簽。其中，在目標(biāo)基因5’端設(shè)計(jì)Nco I（CCATGG）酶切位點(diǎn)序列和多聚組氨酸標(biāo)簽序列（CATCATCATCATCATCAC），為防止閱讀框移位，在Nco I酶切位點(diǎn)和多聚組氨酸標(biāo)簽序列之間添加保護(hù)堿基CA；此外，在目標(biāo)基因3’端終止密碼子（TAA）之后添加Xho I（CTCGAG）酶切位點(diǎn)；設(shè)計(jì)后的目標(biāo)基因序列利用DNA化學(xué)合成技術(shù)由南京金斯瑞公司合成。

合成后的目標(biāo)基因經(jīng)測序驗(yàn)證無誤后，采用Nco I和Xho I進(jìn)行雙酶切。表達(dá)載體pET28a同樣經(jīng)Nco I和Xho I雙酶切。采用T4-DNA連接酶將純化后的目標(biāo)基因與pET28a質(zhì)粒酶切片段進(jìn)行連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含卡那霉素抗性的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)。挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性克隆送上海生工生物公司測序驗(yàn)證。

1.2 重組mytichitin-1蛋白的表達(dá)、復(fù)性及分離純化

將成功構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)菌株感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含卡納霉素的LB平板培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜。挑取單克隆菌落，于相應(yīng)抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。菌液按照1：100比例擴(kuò)大培養(yǎng)。設(shè)置37°C和15°C兩種培養(yǎng)溫度分別培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200 r/min。在菌液OD630值為0.6～0.8時(shí)加入IPTG（1 mmol/L）進(jìn)行誘導(dǎo)。37°C培養(yǎng)的菌株IPTG誘導(dǎo)時(shí)間為4 h；15°C培養(yǎng)的菌株IPTG誘導(dǎo)時(shí)間為16 h。

IPTG誘導(dǎo)結(jié)束后，收集菌液于1 000×g離心10 min，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌，收集菌體并以裂解液（10 mmol/L 咪唑，50 mmol/L PBS，0.1 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）重懸，冰浴超聲破碎（工作 10 s，間隙10 s，工作90次），低溫8 000×g離心15 min分別收集上清和沉淀（包涵體）。以緩沖液A（10 mmol/L咪唑，8 mol/L 尿素，0.1 mol/L NaCl，0.1 mol/L PBS，pH 8.0）溶解包涵體，之后 8 000 ×g離心 15 min，收集上清液，經(jīng)0.45 μm微孔膜過濾后上樣預(yù)先經(jīng)緩沖液A平衡的鎳柱。之后以緩沖液B（30 mmol/L咪唑，8 mol/L尿素，0.1 mol/L NaCl，0.1 mol/L PBS，pH 8.0）洗柱；再以緩沖液 C（300 mmol/L 咪唑，8 mol/L 尿素，0.1 mol/L NaCl，0.1 mol/L PBS，pH 8.0）洗脫目的蛋白。

經(jīng)鎳柱純化后的目標(biāo)蛋白采用透析復(fù)性策略。分別配置復(fù)性液I，II和III，其中復(fù)性液I配方為：4 mol/L尿素，0.1 mmol/L氧化型谷胱甘肽，0.9 mmol/L還原型谷胱甘肽，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；復(fù)性液II配方為：2 mol/L尿素，0.1 mmol/L氧化型谷胱甘肽，0.9 mmol/L還原型谷胱甘肽，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；復(fù)性液III配方為：0.1 mmol/L氧化型谷胱甘肽，0.9 mmol/L還原型谷胱甘肽，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；目的蛋白依次在上述3種復(fù)性液中進(jìn)行4°C攪拌透析（截留分子量為1 kDa），透析時(shí)間均為24 h。

復(fù)性后的目標(biāo)蛋白采用反相高效液相色譜進(jìn)行進(jìn)一步純化。高效液相色譜儀為Waters600 E型（美國，Waters公司），檢測器為Waters 2487雙波長紫外檢測器；色譜柱為C8反相色譜柱（Vydac，218TP）；采用線性梯度洗脫，即B液（含0.1%三氟乙酸的乙腈）在30 min內(nèi)，其比例由20%上升至50%，A液為含0.1%三氟乙酸的純水；流速為1 mL/min；檢測波長為280 nm。

1.3 重組mytichitin-1的鑒定

SDS-PAGE采用4%濃縮膠結(jié)合12%分離膠，樣品事先以電泳上樣緩沖液（上海生工公司）溶解；以牛血清白蛋白（上海生工公司）作為定量分析對照；樣品上樣量為15 μL。采用80 v濃縮膠和120 v分離膠的恒壓模式電泳。電泳結(jié)束后以考馬斯亮藍(lán)R250進(jìn)行膠染色并觀察。

Western印跡分析按如下方法進(jìn)行。首先將電泳分離后的蛋白膠轉(zhuǎn)印至PVDF膜。因所表達(dá)的目標(biāo)蛋白含有多聚組氨酸標(biāo)簽（His-tag），因此，膜經(jīng)洗滌和封閉后，采用鼠抗His-tag抗體（南京金斯瑞公司，貨號A00186）進(jìn)行孵育過夜，之后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗（南京金斯瑞公司，貨號A00160）孵育60 min，以ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影。

對經(jīng)HPLC純化后的重組蛋白開展串聯(lián)質(zhì)譜分析，用以驗(yàn)證所表達(dá)的蛋白的序列是否正確；所用質(zhì)譜儀為4700型串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（4700 Proteomics Analyzer TOF/TOFTM，美國Applied Biosystems公司）。蛋白樣品經(jīng)還原烷基化以及胰蛋白酶酶解后上樣質(zhì)譜儀；質(zhì)譜分析工作電壓為20 kV，采用正離子模式，自動(dòng)模式采集數(shù)據(jù)。PMF質(zhì)量掃描范圍為700～3 600 Da，以強(qiáng)度最大的8個(gè)峰進(jìn)行二級質(zhì)譜分析；譜圖用myoglobin酶解肽段進(jìn)行外標(biāo)校正。根據(jù)肽段的理論序列生成理論胰酶酶切肽段質(zhì)量與肽指紋圖進(jìn)行比對，質(zhì)量相符的肽段進(jìn)一步進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜譜圖分析，獲得其對應(yīng)的氨基酸序列并與理論氨基酸序列進(jìn)行比較。

1.4 重組mytichitin-1的功能分析

幾丁質(zhì)酶的酶解活性采取DNS（3，5-二硝基水楊酸）法測定。幾丁質(zhì)購自sigma公司（貨號c9752）；重組mytichitin-1樣品溶于0.1 M的PBS緩沖液（pH=7），加入底物幾丁質(zhì)后于37°C孵育反應(yīng)90 min；離心后（12 000 g，10 min），上清液中加入事先配置的DNS溶液（含20%酒石酸鈉鉀，1%氫氧化鈉，0.2%苯酚，0.05%亞硫酸鈉和1%的DNS），煮沸反應(yīng)10 min后測定540 nm吸收值。以標(biāo)準(zhǔn)濃度的N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）為底物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到反應(yīng)產(chǎn)生還原糖的含量并計(jì)算相應(yīng)的酶活力。酶活力單位（U）定義為1 min內(nèi)產(chǎn)生1 μMN-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量。蛋白含量測定采用蛋白質(zhì)定量試劑盒（上海生工）依據(jù)說明書進(jìn)行。

抑菌活性實(shí)驗(yàn)采取生長曲線抑制法進(jìn)行測定。細(xì)菌用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD630為0.01）；重組蛋白樣品以滅菌純水溶解，以純水作為陰性對照；將樣品溶液加入菌液中，終濃度為50 μmol/L，樣品和菌液充分混合后置于恒溫箱37°C培養(yǎng)10 h。采用酶標(biāo)儀測定OD630值以衡量多肽對于細(xì)菌生長的抑制作用。重組蛋白樣品對細(xì)菌的相對抑制率根據(jù)實(shí)驗(yàn)組（1-實(shí)驗(yàn)組吸光值/對照組吸光值）×100%進(jìn)行計(jì)算。

幾丁質(zhì)結(jié)合活性采取幾丁質(zhì)孵育結(jié)合SDS-PAGE法測定。將重組蛋白樣品配置成1 mg/mL濃度（樣品1）；加入適量幾丁質(zhì)，充分震蕩混勻后室溫下孵育1 h，再經(jīng)離心處理（4°C，12 000 g，15 min），收集上清液（樣品2）；沉淀部分加入8 M尿素，震蕩混勻1 h后，離心收集上清（樣品3）。利用SDS-PAGE分別對樣品1、2、3進(jìn)行電泳分析；分離膠濃度為12%。樣品按1：1加入電泳上樣緩沖液（上海生工公司）；電泳上樣量為20 μL；采用120 V恒壓模式電泳。電泳結(jié)束后以考馬斯亮藍(lán)R250進(jìn)行膠染色并觀察。

2 結(jié)果

2.1 mytichitin-1基因的設(shè)計(jì)和密碼子優(yōu)化

天然mytichitin-1的成熟肽區(qū)域基因長度為1 266 bp，經(jīng)重新設(shè)計(jì)和優(yōu)化，目標(biāo)基因長度為1 298 bp，兩者的序列比對如圖1所示。重新設(shè)計(jì)的目標(biāo)基因與天然mytichitin-1序列的一致性為68%。

設(shè)計(jì)后的目標(biāo)基因編碼一條長度為429個(gè)氨基酸殘基組成的重組蛋白（圖2），與天然mytichitin-1相比，重組mytichitin-1在N端多出一段MAHHHHHH肽段，其余序列與天然mytichitin-1一致。

進(jìn)一步對優(yōu)化后的目標(biāo)基因開展密碼子適應(yīng)指數(shù)（Codon Adaptation Index，CAI）分析，結(jié)果如圖3所示。mytichitin-1基因在優(yōu)化前，其CAI值經(jīng)OptimumGeneTM軟件在線（http：//www.genscript.com.cn/technology-support/on-line-tools）計(jì)算，為0.62；經(jīng)優(yōu)化后，其CAI值達(dá)到了0.97。CAI值大于0.8則意味著該目標(biāo)基因在大腸桿菌中的表達(dá)效率較高[25]。

2.2 重組mytichitin-1的表達(dá)、純化與鑒定

mytichitin-1重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，收集重組菌菌體，經(jīng)超聲破碎和離心后，上清與沉淀部分分別以SDS-PAGE進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖4所示。從圖4A可以看出，目標(biāo)蛋白主要表達(dá)于沉淀部分，呈包涵體表達(dá)特征。目標(biāo)蛋白條帶約為50 kDa，與重組mytichitin-1的理論分子量（49.1 kDa）接近。進(jìn)一步經(jīng)western blot檢測，所表達(dá)的目標(biāo)條帶能與抗組氨酸抗體結(jié)合并產(chǎn)生特異性亮帶，表明所表達(dá)的重組myti-chitin-1帶有多聚組氨酸標(biāo)簽（圖4B）。

圖1 重組mytichitin-1基因優(yōu)化前后核苷酸序列比對圖Fig.1 Sequence alignment of mytichitin-1 gene before （seq1）and after （seq2）OptimumGeneTMoptimization

圖2 Mytichitin-1基因優(yōu)化后的核苷酸與推導(dǎo)的氨基酸序列比對圖Fig.2 The deduced amino acid sequence of recombinant mytichitin-1 gene

圖3 Mytichitin-1基因經(jīng)優(yōu)化前后的密碼子使用偏好性分布比較圖Fig.3 The distribution of codon usage frequency along the gene sequence of mytichitin-1

圖4 重組mytichitin-1蛋白在大腸桿菌BL21表達(dá)后SDS-PAGE分析（A）和Western blot分析（B）Fig.4 SDS-PAGE with Coomassie blue staining of recombinant myticusin （A）and western blot analysis of recombinant mytichitin-1 （B）

重組mytichitin-1經(jīng)鎳柱分離，以不同濃度的咪唑溶液洗脫，洗脫后的組分以SDS-PAGE進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖5A所示；從圖5A可以看出，重組mytichitin-1在鎳柱分離時(shí)，300 mM咪唑溶液可以充分洗脫目標(biāo)蛋白；經(jīng)鎳柱純化后的重組mytichitin-1經(jīng)復(fù)性處理后，再經(jīng)HPLC純化，結(jié)果如圖5B所示。從圖5B可以看出，復(fù)性后的mytichitin-1經(jīng)HPLC分離，以單峰形式被洗脫，表明其純度較高。

圖5 重組mytichitin-1分離純化圖譜Fig.5 Isolation and purification of recombinant mytichitin-1

為驗(yàn)證純化后的mytichitin-1的氨基酸序列，進(jìn)一步收集目標(biāo)峰開展酶解后串聯(lián)質(zhì)譜分析，共分析3個(gè)肽段，分子量分別為 1 703.69（圖 6A）、1 831.78（圖 6B）和 1 853.80 Da（圖 6C）；3 個(gè)肽段的序列分析結(jié)果分別為“-HNFDGLDLDLEYPR-”、“-HNFDGLDLDLEYPRK-”和“-IAADLDFINLMAYDLR-”，分別對應(yīng)重組mytichitin-1分子序列中第124～137、124～138和194～209肽段；上述結(jié)果表明重組蛋白的序列正確，表達(dá)成功。

圖6 復(fù)性及純化后的重組mytichitin-1質(zhì)譜分析圖Fig.6 LC-MS/MS spectrum of recombinant mytichitin-1

2.3 重組mytichitin-1的功能

采用DNS法分別測試了重組菌發(fā)酵液，鎳柱純化后的重組mytichitin和復(fù)性后的mytichitin-1的功能，結(jié)果如圖7A所示。從圖7A可以看出，含重組mytichitin-1的大腸桿菌發(fā)酵液（fermentation broth，F(xiàn)R）具有一定的幾丁質(zhì)酶酶解活性；復(fù)性前（before refolding，BR）的重組mytichitin-1其幾丁質(zhì)酶解活性較弱，而復(fù)性后（after refolding，AR）的重組mytichitin-1則活性較強(qiáng)。復(fù)性后的重組mytichitin-1的功能分析結(jié)果如圖7B-D。從圖5A可以看出，重組mytichitin-1對幾丁質(zhì)的催化在50 min左右達(dá)到最高值；而重組mytichitin-1催化幾丁質(zhì)降解活性在pH值為4左右（圖7B），以及溫度在40°C左右（圖7D），其活性最強(qiáng)。

圖7 重組mytichitin-1活性檢測圖Fig.7 Chitinase activity of recombinant mytichitin-1

采用生長曲線抑制法測定重組mytichitin-1對藤黃疊球菌Sarcina lutea（ATCC4698）、鰻弧菌Vibrio anguillarum（ATCC43306）、黑曲霉 Aspergillus niger（ATCC16404） 以及白色念球菌 Monilia albican（ATCC10231）的相對抑制率，結(jié)果如圖8A所示。從圖8A可以看出，重組mytichitin-1在50 μmol/L濃度下，對上述4種微生物的相對抑制率分別為33%、54%、65%和72%。

重組mytichitin-1的幾丁質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8B所示，采用幾丁質(zhì)孵育結(jié)合SDS-PAGE法檢測mytichitin-1的幾丁質(zhì)結(jié)合活性，從圖8B可以看出，mytichitin-1與幾丁質(zhì)具有明顯的結(jié)合活性，在與幾丁質(zhì)孵育1 h并離心后，上清液經(jīng)SDS-PAGE檢測無目標(biāo)條帶（圖8B泳道2）。該結(jié)合活性可被8 M尿素解除（圖8B泳道3）。

圖8 重組mytichitin-1的抑菌試驗(yàn)和幾丁質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖Fig.8 The antimicrobial activity and chitin-binding activity of recombinant mytichitin-1

3 討論

幾丁質(zhì)酶作為一種分布極為廣泛且存在多種生物學(xué)功能的酶，歷來是酶學(xué)研究的重要對象。厚殼貽貝幾丁質(zhì)酶mytichitin-1的序列中含有一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域（N端）、一個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域（C端）以及連接兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的接頭序列。在前期研究中，發(fā)現(xiàn)mytichitin-1其C端55個(gè)殘基的多肽可在體內(nèi)裂解并作為抗菌肽（mytichitin-CB）分泌至血淋巴中發(fā)揮免疫防御作用[17]。該裂解現(xiàn)象在其他物種的幾丁質(zhì)酶研究中也有少量發(fā)現(xiàn)。例如，GAL，et al[26]曾經(jīng)報(bào)道過粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens的52 kD幾丁質(zhì)酶可通過裂解產(chǎn)生另一種35 kD的幾丁質(zhì)酶，兩種酶的催化活性類似，但其裂解的生物學(xué)意義不清楚；此外，NAUMANN，et al[27]發(fā)現(xiàn)，植物的IV型幾丁質(zhì)酶可被真菌蛋白酶裂解成兩個(gè)片段，分別為酶催化活性域和幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這種裂解可能是植物在遭受真菌侵害時(shí)的一種免疫防御機(jī)制。由此可見，厚殼貽貝幾丁質(zhì)酶mytichitin-1的體內(nèi)裂解現(xiàn)象不是個(gè)例，可能在不同物種中均存在此類現(xiàn)象并與該物種的免疫防御機(jī)制存在重要聯(lián)系。因此，本研究以厚殼貽貝mytichitin-1為研究對象，采取了密碼子優(yōu)化策略結(jié)合原核重組表達(dá)獲得重組蛋白樣品并開展相關(guān)功能研究。

采用密碼子優(yōu)化結(jié)合原核重組表達(dá)策略，成功表達(dá)出mytichitin-1的重組蛋白，其表達(dá)量達(dá)到40 mg/L發(fā)酵液。通過western、質(zhì)譜等手段驗(yàn)證重組mytichitin-1的序列表達(dá)正確。進(jìn)一步的功能分析表明，重組mytichitin-1具有明顯的幾丁質(zhì)降解活性，表明重組mytichitin-1在N端的組氨酸標(biāo)簽并未對其功能產(chǎn)生明顯影響；此外，重組mytichitin-1在氧化復(fù)性后，其活性明顯比復(fù)性前要強(qiáng)（P＜0.01）。這表明氧化復(fù)性有利于重組mytichitin-1的正確折疊，特別是重組mytichitin-1的C端幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域含6個(gè)半胱氨酸并形成3對二硫鍵[17]，因此，氧化復(fù)性能促進(jìn)其二硫鍵的正確配對并確保其功能的正常發(fā)揮。同時(shí)，我們也注意到，含有重組mytichitin-1的大腸桿菌發(fā)酵液也具有一定的幾丁質(zhì)酶解活性，考慮到重組mytichitin-1在大腸桿菌15°C誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，其發(fā)酵液中也存在少量重組蛋白（圖4B的9號泳道），表明含重組mytichitin-1的大腸桿菌在低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)下可能存在少量的分泌型表達(dá)方式，但是也不排除該酶解活性可能來自于大腸桿菌自身的幾丁質(zhì)酶的影響。重組mytichitin-1的酶解活性最佳pH為4左右，這可能與其活性位點(diǎn)（-DGLDLDLE-）富含酸性氨基酸（谷氨酸及天冬氨酸）有關(guān)聯(lián)[17]；重組mytichitin-1的最佳催化溫度為40°C左右，且在60°C條件下仍保持約70%的活性，表明重組mytichitin-1具有較好的熱穩(wěn)定性，該特征也與其他物種的幾丁質(zhì)酶類似[28-29]。幾丁質(zhì)酶的序列中多數(shù)情況下存在幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與幾丁質(zhì)酶與底物的結(jié)合具有關(guān)聯(lián)，且該結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是幾丁質(zhì)酶能降解不溶性幾丁質(zhì)的關(guān)鍵因素，因此，缺失這一結(jié)構(gòu)域的幾丁質(zhì)酶只能降解可溶性幾丁質(zhì)，二不能催化不溶性幾丁質(zhì)的降解[30]。幾丁質(zhì)酶中的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域根據(jù)其二硫鍵數(shù)量可分為I型（4對二硫鍵）和II型（3對二硫鍵）[31]；重組mytichitin-1的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域含3對二硫鍵，屬II型結(jié)構(gòu)域。在本研究中，重組mytichitin-1對幾丁質(zhì)具有明顯的結(jié)合活性，且該活性在加入尿素促使蛋白變性后得到解除（圖8A）。

抑菌活性實(shí)驗(yàn)表明，重組mytichitin-1對所測試4種微生物均有抑制作用，且表現(xiàn)出對真菌的抑制活性較強(qiáng)，對革蘭氏陰性菌的抑制活性較弱。在所測試的4種菌中，重組mytichitin-1在50 mol/L濃度下對2種真菌的抑制率均在60%以上，而對鰻弧菌和藤黃疊球菌的抑制率相對較低。幾丁質(zhì)酶的抑菌活性已有相關(guān)報(bào)道，且多數(shù)集中在幾丁質(zhì)酶的抗真菌活性方面[32-33]。此外，針對貝類的幾丁質(zhì)酶研究也發(fā)現(xiàn)該酶與貝類的免疫防御存在相關(guān)性，在細(xì)菌誘導(dǎo)下，貝類的幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量呈明顯上升趨勢[34-35]。但是與天然mytichitin-CB（mytichitin-1的C端肽）相比[17]，重組mytichitin-1的抑菌活性相對較弱，這表明，厚殼貽貝mytichitin-1通過裂解獲得抑菌活性更強(qiáng)的多肽片段可能是幾丁質(zhì)酶發(fā)揮免疫防御作用的一種重要方式。

貝類幾丁質(zhì)酶目前被認(rèn)為與貝類的發(fā)育[35]、消化[36]、貝殼的形成[37]和免疫[38]等生理功能存在重要關(guān)系。因此，對貝類幾丁質(zhì)酶的研究不僅有助于了解幾丁質(zhì)酶的功能多樣性，也有助于了解幾丁質(zhì)酶參與不同生理學(xué)功能的分子機(jī)制，從而為幾丁質(zhì)酶的分子進(jìn)化研究以及基于幾丁質(zhì)酶的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。對厚殼貽貝幾丁質(zhì)酶mytichitin-1的原核重組表達(dá)及功能分析，為幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究以及在此基礎(chǔ)上的蛋白質(zhì)工程研究奠定了基礎(chǔ)。