聲動(dòng)力治療在動(dòng)脈粥樣硬化中的應(yīng)用進(jìn)展

謝茜，趙云，劉蓉

動(dòng)脈粥樣硬化是一種因脂質(zhì)代謝和免疫應(yīng)答障礙引起的慢性炎癥性血管疾病。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的積累使動(dòng)脈管腔狹窄、閉塞，從而導(dǎo)致缺血性血管疾病，如冠心病、周圍血管疾病、腦動(dòng)脈疾病等［1］。目前，針對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的治療方式主要有控制飲食、適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動(dòng)、戒煙限酒等綜合治療；降脂、抗血小板聚集、擴(kuò)張血管、溶栓、抗凝等藥物治療；重建、搭橋等外科介入手術(shù)治療［2］。這些治療方法在臨床上均取得了一定的治療效果，但存在治療周期長(zhǎng)，不良反應(yīng)大，且具有侵入性的問(wèn)題。研究顯示，他汀類降脂藥物可明顯改善冠心病患者的生存期，但其擴(kuò)血管作用較小，且這種藥物最低需要幾個(gè)月才能達(dá)到動(dòng)脈邊緣水平的斑塊逆轉(zhuǎn)；經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療可迅速擴(kuò)大管腔并進(jìn)行血管重建，改善心肌缺血癥狀，但容易導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈痙攣、支架內(nèi)血栓和再狹窄等并發(fā)癥［3］。新型治療方法——聲動(dòng)力治療（sonodynamic therapy，SDT）可抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展，具有安全、局部治療對(duì)正常的組織影響較小、組織穿透能力強(qiáng)且能量無(wú)明顯衰減等優(yōu)點(diǎn)。本研究就SDT對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的作用及其機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 聲動(dòng)力治療與聲敏劑

SDT是一種依靠低強(qiáng)度超聲和聲敏劑協(xié)同作用產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）的新型無(wú)創(chuàng)治療方法。聲敏劑可優(yōu)先特異性聚集在病變組織，聚焦超聲可激活聲敏劑在局部產(chǎn)生ROS，從而進(jìn)行氧化損傷，達(dá)到較高的治療效果。SDT是在光動(dòng)力療法的基礎(chǔ)上由日本學(xué)者Yumita等［4］提出的一種新的非侵入性的疾病治療方法。SDT與光動(dòng)力療法的最大不同是超聲波可穿透人體深部組織，對(duì)需要治療的特定病理部位的作用更集中［5］。SDT最初運(yùn)用于實(shí)體腫瘤，早在1989年Yumita等［4］就發(fā)現(xiàn)聲敏劑血卟啉介導(dǎo)的超聲治療提高了超聲對(duì)小鼠肉瘤180和腹水肝癌130細(xì)胞的敏感性，殺傷了更多的腫瘤細(xì)胞，由此提出了聲動(dòng)力治療。Arakawa等［6］研究顯示，SDT在兔髂動(dòng)脈支架模型中有抑制內(nèi)膜增生的作用。目前，SDT已被證實(shí)可引起細(xì)胞凋亡和自噬，具有改善脂質(zhì)沉積、減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞再增殖、防止基質(zhì)降解等作用。

聲敏劑按其生物學(xué)功能和化學(xué)結(jié)構(gòu)主要分成五大類：卟啉類化合物、黃原酮類化合物、抗腫瘤藥物、非甾體類抗炎藥和其他類型（二氫卟吩、新型納米分子和亞甲藍(lán)等）的聲敏劑。大多數(shù)聲敏劑已被研究用于現(xiàn)代腫瘤的治療，然而評(píng)估其在動(dòng)脈粥樣硬化的潛在效果研究主要集中在原卟啉IX（protoporphyrin IX,PpIX）和5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，5-ALA），這兩種聲敏劑可以選擇性地聚集在動(dòng)脈斑塊中，斑塊中的濃度大約是正常血管壁的10～12倍，在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均被證實(shí)具有良好的腫瘤治療效果［7］。值得注意的是，近幾年從中草藥提取物中發(fā)現(xiàn)的某些化合物如羥色胺黃A（ hydroxysafflor yellow A、HSYA）、金 絲 桃 素（hypericin,HY）也具有強(qiáng)大的聲動(dòng)力學(xué)活性，且治療過(guò)程中少見(jiàn)由聲敏劑所引起的光敏性皮炎［8］。

2 細(xì)胞凋亡與細(xì)胞自噬

細(xì)胞凋亡的過(guò)程主要有外源性和內(nèi)源性兩種通路：（1）外源性的死亡受體通路。死亡受體包括腫瘤壞死因子受體和神經(jīng)生長(zhǎng)因子超家族，主要有Fas、Apo-1、TRAM受體等。以Fas受體為例，當(dāng)Fas受體與Fas配體結(jié)合后，導(dǎo)致Fas受體胞質(zhì)區(qū)域內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合Fas結(jié)合蛋白（Fas-associated with death domain protein,FADD），F(xiàn)ADD再以其氨基端的死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域結(jié)合半胱天冬酶-8（cystein aspartic acid specific protease，caspase-8）前體，形成由 Fas-FADD-caspase-8前體組成的死亡片段復(fù)合物，激活caspase-8，活化的caspase-8再進(jìn)一步激活caspase-3、caspase-6、caspase-7等后續(xù)一系列反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［10］。（2）內(nèi)源性的線粒體通路。線粒體是有核細(xì)胞能量產(chǎn)生與代謝的主要部位，而高能磷酸化合物可作為一種信號(hào)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞有效吞噬。許多凋亡基因（如bcl-2家族）都位于線粒體膜上，凋亡基因與線粒體膜結(jié)合導(dǎo)致線粒體釋放細(xì)胞色素 C（cytochrome C，cytC），cytC 進(jìn)入胞漿，與caspase-9的前體結(jié)合，激活caspase-9，活化的caspase-9進(jìn)一步引起后續(xù)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［11］。

2.2細(xì)胞自噬 細(xì)胞自噬通常被認(rèn)為是機(jī)體一種重要的防御和保護(hù)機(jī)制，細(xì)胞降解非必需的、衰老的或者無(wú)功能的蛋白質(zhì)或細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器，并回收這些降解的成分以維持正常的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡。最近研究表明，自噬在調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化形成和增強(qiáng)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用［12］。自噬可以選擇性地清除動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細(xì)胞，降解脂質(zhì)，在晚期動(dòng)脈粥樣硬化中，巨噬細(xì)胞自噬可以減少炎癥反應(yīng)［13］。

細(xì)胞自噬的形成過(guò)程為細(xì)胞胞漿形成雙層膜的囊泡，囊泡包裹細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器形成自噬體，自噬體逐漸變成單層膜后與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，然后溶酶體中多種不同的酶降解細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞器形成氨基酸和核苷酸，為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供能量。目前，雙層膜的囊泡來(lái)源并不清楚，有可能來(lái)自于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體，也有可能是細(xì)胞自身合成。其中許多ATG相關(guān)基因參與自噬的調(diào)節(jié)，Atg復(fù)合蛋白和微管相關(guān)蛋白質(zhì)輕鏈3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）泛素化有著重要的地位，Atg復(fù)合蛋白與外膜結(jié)合，可促進(jìn)自噬體形狀的改變，同時(shí)微管相關(guān)蛋白質(zhì)1輕鏈3（microtubuleassociated protein 1 light chain 3，LC3-Ⅰ）蛋白被泛素化形成微管相關(guān)蛋白質(zhì)2輕鏈3（microtubule-associated protein 2 light chain 3，LC3-Ⅱ），定位于膜上，因此，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ可以用來(lái)衡量自噬水平的高低［14］。

3 聲動(dòng)力治療與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬

聲動(dòng)力治療的基本機(jī)制理念有空化效應(yīng)、自由基理論、ROS生成、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞自噬。超聲激活聲敏劑產(chǎn)生ROS，是SDT發(fā)揮作用的主要機(jī)制之一。ROS不僅在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用，在動(dòng)脈粥樣硬化治療中也至關(guān)重要，目前，SDT在組織或細(xì)胞中產(chǎn)生ROS有2種可能的假說(shuō)。第一種是聲致發(fā)光假說(shuō)，超聲波在水性環(huán)境中產(chǎn)生稱為空化的現(xiàn)象，空化產(chǎn)生充滿氣體的氣泡，氣泡在一定程度上爆裂?？栈?yīng)根據(jù)超聲條件和組織或細(xì)胞狀態(tài)可分為兩種類型：穩(wěn)定空化和慣性空化，前者產(chǎn)生溫和的氣泡，其中大多數(shù)處于連續(xù)振動(dòng)和振蕩狀態(tài)。后者與ROS生成關(guān)系更密切，產(chǎn)生的氣泡劇烈震蕩吸收更多的聲能，導(dǎo)致氣泡劇烈坍塌，在較小范圍內(nèi)產(chǎn)生極端的物理?xiàng)l件，隨后發(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng)。在此過(guò)程中，氣泡積累了大量的能量，這些能量經(jīng)歷物理聲致光現(xiàn)象以發(fā)光，產(chǎn)生的光可以激活聲敏劑，在微觀水平上誘發(fā)聲敏劑分子的電子軌道激發(fā)，一旦被激發(fā)的電子回到基態(tài)，釋放的電離輻射就可以在靶組織中產(chǎn)生ROS［15］。另一種假說(shuō)是熱解假說(shuō)，該假說(shuō)認(rèn)為當(dāng)氣泡通過(guò)慣性空化劇烈坍縮時(shí)，局部溫度迅速上升至大約9 727℃，導(dǎo)致聲敏劑分解產(chǎn)生自由基，自由基與內(nèi)源性物質(zhì)進(jìn)一步反應(yīng)生成ROS。體內(nèi)多種抗氧化酶和低分子量抗氧化劑在正常生理?xiàng)l件下清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的ROS，然而，SDT導(dǎo)致ROS濃度較高，不能迅速清除并保留在細(xì)胞中，從而使ROS在隨后引發(fā)多種效應(yīng)［16］。

Li等［17］通過(guò)研究大鼠細(xì)胞凋亡與ROS的關(guān)系，證實(shí)了ROS通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且ROS在細(xì)胞凋亡中起決定性作用。Yumita等［18］通過(guò)多羥基富勒烯研究SDT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，在SDT處理的細(xì)胞中可見(jiàn)DNA片段化和caspase-3活化，證實(shí)了SDT產(chǎn)生了細(xì)胞凋亡；同時(shí)使用活性氧清除劑組氨酸后，顯著抑制了caspase-3活化，從而抑制了SDT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。楊力明等［19］在羥基乙?；S素介導(dǎo)的SDT中證實(shí)，SDT通過(guò)細(xì)胞凋亡穩(wěn)定了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，且5 mg/L是該聲敏劑最佳的治療濃度。Zhuang等［20］通過(guò)甘氨酸脫羧酶誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ROS通過(guò)激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）途徑誘導(dǎo)非經(jīng)典自噬，且氧化還原依賴的自噬在很大程度上依賴于ROS生成的大小和速率。Han等［12］證實(shí)，二氫卟吩介導(dǎo)的SDT通過(guò)產(chǎn)生ROS激活自噬，并可抑制巨噬細(xì)胞促炎因子的表達(dá)。

4 聲動(dòng)力治療對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的作用

4.1SDT介導(dǎo)細(xì)胞凋亡在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用 動(dòng)脈粥樣硬化由動(dòng)脈壁中的修飾脂蛋白如氧化的低密度脂蛋白的積累引發(fā)。在動(dòng)脈粥樣硬化早期，單核細(xì)胞被招募到動(dòng)脈壁內(nèi)膜，以應(yīng)對(duì)脂蛋白所造成的損傷，并分化成巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞通過(guò)清道夫受體攝取脂蛋白并轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，幫助脂蛋白停留在動(dòng)脈壁上。在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展過(guò)程中，泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)不斷積累，導(dǎo)致慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，使泡沫細(xì)胞壞死，同時(shí)巨噬細(xì)胞分泌促炎因子，引起炎癥反應(yīng)［21］。由于晚期粥樣硬化斑塊的吞噬功能缺陷，壞死的泡沫細(xì)胞不能有效地通過(guò)胞吐作用被清除，泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇被釋放在斑塊中，從而進(jìn)一步導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生［22］。Wang等［23］通過(guò)用5-ALA介導(dǎo)的SDT處理西藥喂養(yǎng)的apoE-/-小鼠，分別于治療后第1、3、7、28天處死小鼠，結(jié)果表明5-ALA介導(dǎo)的SDT可導(dǎo)致泡沫細(xì)胞通過(guò)線粒體途徑凋亡，顯著降低晚期斑塊的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減輕了炎癥反應(yīng)，且第28天處死的小鼠的炎癥反應(yīng)最輕，表明5-ALA介導(dǎo)的SDT具有一定的時(shí)間依賴性；另外，斑塊中Mer酪氨酸激酶（Mer酪氨酸激酶對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬和有效清除至關(guān)重要）陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞顯著增多，表明5-ALA介導(dǎo)的SDT提高了巨噬細(xì)胞的吞噬能力。Sun等［24］在動(dòng)脈硬化晚期的兔和載脂蛋白缺乏的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，5-ALA介導(dǎo)的SDT誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，且多數(shù)凋亡細(xì)胞表達(dá)出巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD68（一種細(xì)胞漿糖蛋白），表明SDT在體內(nèi)誘導(dǎo)了有缺陷的巨噬細(xì)胞凋亡，并在治療后的第3天可見(jiàn)斑塊中出現(xiàn)更多有胞吐功能的單核細(xì)胞，作用是清除凋亡的巨噬細(xì)胞，同時(shí)可見(jiàn)促炎因子的減少及抗炎因子的增加，表明SDT改善了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的炎癥環(huán)境?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），導(dǎo)致纖維帽變薄，進(jìn)一步引起斑塊的破裂和血栓的形成，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊失穩(wěn)的進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，同時(shí)MMPs可裂解凋亡受體，抑制細(xì)胞凋亡。因此，MMPs可能是治療動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成和預(yù)防急性心血管事件的治療靶點(diǎn)［25］。Li等［26］在兔的動(dòng)脈粥樣斑塊模型中，通過(guò)5-ALA介導(dǎo)的SDT有效誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化巨噬細(xì)胞的凋亡，抑制了MMPs的產(chǎn)生，穩(wěn)定了粥樣斑塊；且觀察到超聲強(qiáng)度1.5 W/cm2、頻率1.0 MHz，持續(xù)時(shí)間15 min、5-ALA的濃度為60 mg/kg時(shí)，5-ALA介導(dǎo)的SDT對(duì)粥樣硬化斑塊中巨噬細(xì)胞的清除能力最強(qiáng)。

4.2SDT介導(dǎo)細(xì)胞自噬在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用 動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中容易破壞的斑塊稱為易損斑，易損斑的特點(diǎn)是有大量脂質(zhì)核心，薄纖維帽、血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMCs）和膠原蛋白較少，巨噬細(xì)胞密度高，ECM合成和降解不平衡。VSMCs在正常血管中表現(xiàn)出分化表型，在斑塊形成過(guò)程中，它們攝取脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為去分化表型，最終轉(zhuǎn)化為病灶內(nèi)的泡沫細(xì)胞。VSMCs誘導(dǎo)的自噬可以阻止氧化的低密度脂蛋白觸發(fā)VSMCs來(lái)源的泡沫細(xì)胞形成，使VSMCs表現(xiàn)出分化表型；反之，缺乏VSMCs自噬可以改變鈣離子平衡而影響血管的收縮能力，因此，VSMCs的分化和自噬在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可能是動(dòng)脈粥樣硬化的治療靶點(diǎn)。Li等［27］通過(guò)評(píng)價(jià)PpIX介導(dǎo)的SDT對(duì)VSMCs的活力和自噬的影響觀察到，SDT沒(méi)有引起VSMCs細(xì)胞凋亡；同時(shí)，SDT增加了LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，并顯著增加了自噬體形成；PpIX-SDT可增加VSMCs的自噬，但不誘導(dǎo)線粒體依賴性細(xì)胞凋亡，穩(wěn)定了粥樣斑塊。在正常情況下，氧化的低密度脂蛋白在巨噬細(xì)胞中可以自發(fā)觸發(fā)自噬，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，然而，低水平的自噬很難逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)積累，且脂質(zhì)可導(dǎo)致溶酶體功能障礙，進(jìn)而導(dǎo)致自噬缺陷［28］。另有研究顯示，SDT可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬活性達(dá)到有效水平，通過(guò)自噬調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝來(lái)阻止斑塊進(jìn)展［29］。

HSYA是紅花植物親水性成分的主要組成部分，是一種靜脈注射治療心血管疾病的中藥，水溶性好，安全性高。Jiang等［30］認(rèn)為HSYA可以作為聲敏劑，聯(lián)合超聲通過(guò)促進(jìn)ROS生成，誘導(dǎo)人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株（THP-1）巨噬細(xì)胞自噬，同時(shí)上調(diào)ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1；一種膽固醇流出調(diào)節(jié)蛋白）表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞和巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的膽固醇外溢，抑制炎癥反應(yīng)。Li等［31］通過(guò)研究中藥提取物金絲桃素（hypericin，HY）在THP-1巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬的潛在機(jī)制顯示，HY介導(dǎo)的SDT通過(guò)調(diào)節(jié)ROS依賴的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子EB（trancription factor EB，TFEB；一種自噬激活劑）核易位，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬和溶酶體再生，促進(jìn)脂質(zhì)的降解，且TFEB的易位在SDT的2 h達(dá)到最強(qiáng)。因此，有些中藥提取物介導(dǎo)的SDT可誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生自噬和溶酶體再生，有效降低脂質(zhì)含量，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

5 問(wèn)題與展望

SDT作為一種新的治療技術(shù)，已被證實(shí)具有改善脂質(zhì)沉積、減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞分化、防止基質(zhì)降解等作用，這些作用共同發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。然而，SDT在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的作用是復(fù)雜的，對(duì)實(shí)驗(yàn)員的操作要求高，同時(shí)聲敏劑種類和濃度、超聲參數(shù)（頻率、強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間等）及治療時(shí)間等有待進(jìn)一步研究，但目前SDT多處于臨床試驗(yàn)階段，相信在不久的將來(lái)，聲動(dòng)力治療將用于臨床，有望成為一種新的治療方法。