小柴胡湯聯(lián)合紫杉醇對CAL27荷瘤鼠腫瘤組織中Survivin和caspase-3表達(dá)水平的影響

邢永新

(興安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 烏蘭浩特 137400)

口腔鱗癌在口腔癌中約占比例90%以上，其生長迅速、侵襲力和轉(zhuǎn)移率高，發(fā)病機(jī)制尚不清楚，治療手段多為手術(shù)及輔助治療〔1～3〕。有研究〔4～6〕表明小柴胡湯能提高機(jī)體免疫力并對腫瘤有抑制作用，其在S180、Lewis、C6等荷瘤鼠中的抗腫瘤作用已被證實。化療藥物紫杉醇能抑制腫瘤增殖細(xì)胞的有絲分裂、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡〔7〕。本實驗探索小柴胡湯聯(lián)合紫杉醇用藥對人口腔鱗癌細(xì)胞(CA227)荷瘤鼠腫瘤組織中Survivin和caspase-3表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料和試劑 小柴胡湯其成分主要為：柴胡(78.125 g)；黃芩3兩(46.875 g)；人參3兩(46.875 g)；清半夏半升(42.000 g)；炙甘草3兩(46.875 g)；生姜3兩(46.875 g)；大棗(30.000 g)。紫杉醇由Sigma公司提供；人口腔鱗癌細(xì)胞CAL27購于長春鼎國生物有限公司；引物、Trizol、實時熒光定量PCR試劑盒購于北京鼎國生物有限公司；兔抗Survivin和caspase-3購于北京博奧森生物有限公司；SP9710試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購于福州邁新生物有限公司。

1.2模型制備 培養(yǎng)人口腔鱗癌CAL27細(xì)胞，制備1×106/10 μl的CAL27細(xì)胞懸液，在雄性9周齡BALB/c裸鼠，體重(25.3±1.6)g，右前肢腋窩皮下接種。

1.3實驗分組、給藥及取材 待腫瘤長至120～150 mm3時，隨機(jī)分為4組(n=10)：腫瘤對照組、小柴胡湯組(50 g/kg)、紫杉醇組(30 mg/kg)、聯(lián)合用藥組；每組分別灌胃和腹腔注射生理鹽水或相應(yīng)藥物，劑量均為0.1 ml，連續(xù)隔天給藥7次，于最后一次給藥后次日處死動物，摘取腫瘤組織(部分-20℃凍存待測，部分固定于4%多聚甲醛液中)。

1.4指標(biāo)檢測 (1)CAL27荷瘤鼠腫瘤組織中Survivin、caspase-3 mRNA水平的檢測。Trizol提取腫瘤組織總RNA，每個樣本基因擴(kuò)增3次，行實時熒光定量PCR檢測Survivin、caspase-3 mRNA水平，取Ct值均值，采用2-ΔΔCt表示目的基因相對表達(dá)水平。(2)CAL27荷瘤鼠腫瘤組織中Survivin、caspase-3蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)度的檢測。常規(guī)石蠟包埋，切片3 μm兩張，80℃烤箱烘烤6 h，然后脫蠟至梯度酒精至水洗，采用檸檬酸抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，分別滴加Survivin、caspase-3抗體，抗體稀釋液濃度均為1∶800，嚴(yán)格按照說明書操作，DAB顯色后，用蘇木精復(fù)染，樹膠封片。用OLYMPUS BX51顯微鏡觀察攝取圖片，采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析軟件，檢測光密度值(OD值)，OD值越大陽性表達(dá)越強(qiáng)。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組CAL27荷瘤鼠腫瘤組織中Survivin、caspase-3 mRNA水平的比較 與腫瘤對照組比較，小柴胡湯、紫杉醇、聯(lián)合用藥組CAL27荷瘤鼠腫瘤組織中Survivin mRNA水平均降低，且依次降低趨勢明顯，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，caspase-3 mRNA水平均升高，且依次升高趨勢明顯，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2各組CAL27荷瘤鼠腫瘤組織中Survivin、caspase-3蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)度比較 與腫瘤對照組比較，小柴胡湯、紫杉醇、聯(lián)合用藥組CAL27荷瘤鼠腫瘤組織中Survivin蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)度均降低，且依次降低趨勢明顯，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，caspase-3蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)度均升高，且依次升高趨勢明顯，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、2，表1。

圖1 CAL27荷瘤鼠腫瘤組織中Survivin蛋白陽性表達(dá)(DAB，×200)

圖2 CAL27荷瘤鼠腫瘤組織中caspase-3蛋白陽性表達(dá)(DAB，×200)

表1 CAL27荷瘤鼠腫瘤組織中Survivin、caspase-3蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)度及mRNA水平比較

與腫瘤對照組比較：1)P<0.05；與小柴胡湯組比較：2)P<0.05； 與紫杉醇組比較：3)P<0.05

3 討 論

紫杉醇提取于紫杉屬樹皮，是美國FDA批準(zhǔn)的抗癌癥臨床藥物，它能促進(jìn)微管聚合抑制微管解聚形成穩(wěn)定的微管聚合物，從而抑制腫瘤增殖細(xì)胞的有絲分裂促進(jìn)細(xì)胞凋亡，目前已證實在多種實體瘤的治療中有較高的療效〔7，8〕。 小柴胡湯為中醫(yī)經(jīng)典方劑，它具有疏肝利膽、通達(dá)表里陰陽、協(xié)調(diào)臟腑等多種功用〔9〕。近年研究發(fā)現(xiàn)小柴胡湯還能降低化療藥物對機(jī)體臟器的損傷，通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化提高機(jī)體細(xì)胞免疫及體液免疫功能〔10，11〕。目前研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的重要成員之一，其結(jié)構(gòu)獨特能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、細(xì)胞凋亡及信號傳導(dǎo)，在腫瘤組織中高表達(dá)〔12〕。caspase-3 是一種半胱氨酸蛋白酶，以非激活的酶原形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，是細(xì)胞凋亡重要的效應(yīng)分子及核心執(zhí)行者，是凋亡促進(jìn)因子〔13〕。Survivin在細(xì)胞凋亡過程不但可以抑制caspase-3的活性，而且又可間接抑制caspase-3激活，從而阻斷細(xì)胞的凋亡過程，因此Survivin、caspase-3參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程〔14，15〕。