雌激素對(duì)去卵巢大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及海馬一氧化氮合酶表達(dá)的影響

蘇曉云 賀繼平 鄭華 李文青

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院 1護(hù)理學(xué)系護(hù)理人文教研室，山西 汾陽(yáng) 032200；2解剖教研室；3重慶師范大學(xué)體育學(xué)院；4濟(jì)寧市榮復(fù)軍人醫(yī)院精神科)

雌二醇(E2)主要由卵巢分泌，不僅可以調(diào)節(jié)性腺及機(jī)體的生殖活動(dòng)，還可增加腦血流量及提高神經(jīng)突觸的活性，對(duì)記憶和認(rèn)知功能也有很大影響〔1〕。更年期由于卵巢卵泡活動(dòng)減少導(dǎo)致雌激素分泌減少可引起多種生理和心理疾病〔2〕。已經(jīng)表明，雌激素缺乏與神經(jīng)退行性疾病，包括腦卒中和阿爾茨海默病(AD)等發(fā)病有關(guān)。Loring-Meier等〔3〕認(rèn)為絕經(jīng)前女性AD發(fā)病率遠(yuǎn)低于同齡男性，而絕經(jīng)期婦女AD發(fā)病率比同期男性高1.5～3.0倍。研究認(rèn)為，雌激素有助于保持記憶和認(rèn)知能力，減少和延遲神經(jīng)障礙發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)，并且多數(shù)學(xué)者認(rèn)為雌激素替代(HRT)療法可以延緩和阻止絕經(jīng)期婦女認(rèn)知功能下降。Gibbs等〔4〕通過(guò)雌激素剝奪模擬婦女絕經(jīng)后狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)去卵巢(OVX)大鼠給予雌激素替代治療后空間工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)及參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)均顯著改善，這些結(jié)果提示E2可能在女性更年期認(rèn)知功能下降方面起到很重要的作用。

一氧化氮(NO)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)信使可介導(dǎo)神經(jīng)信號(hào)傳遞和突觸可塑性形成，被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶的主要細(xì)胞機(jī)制之一〔5〕。NO由一氧化氮合酶(nNOS)催化產(chǎn)生，研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可通過(guò)激活NMDA受體，增強(qiáng)nNOS的表達(dá)，激活NO信號(hào)，增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力〔6〕。在正常生理情況下，nNOS催化產(chǎn)生的NO與大腦許多區(qū)域包括海馬功能改變引起的認(rèn)知功能下降有關(guān)。海馬是邊緣系統(tǒng)學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵部位，可介導(dǎo)多種形式的學(xué)習(xí)和記憶并與突觸可塑性形成有關(guān)，E2在調(diào)節(jié)海馬功能方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Tuscher等〔7〕認(rèn)為海馬是雌激素作用的靶點(diǎn)之一，而且在某種程度上與卵巢摘除引起的認(rèn)知功能下降有關(guān)。因此，E2改善OVX導(dǎo)致的認(rèn)知功能下降可能是通過(guò)調(diào)節(jié)大腦某些區(qū)域nNOS的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

基于以上假設(shè)，本實(shí)驗(yàn)利用雌性O(shè)VX大鼠模擬絕經(jīng)后女性，以海馬為研究重點(diǎn)，探討E2改善OVX大鼠認(rèn)知功能的可能機(jī)制。

1 材料及方法

1.1動(dòng)物及分組 SD成年雌性大鼠30只，體重220～250 g，標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)飼料飼養(yǎng)，每籠3只，自由攝食、飲水，室溫22～24℃，濕度45%～65%，光暗周期為(光照8∶00～20∶00；黑暗20∶00～8∶00)。將30只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(SHAM組)、OVX組、去卵巢雌二醇組(OVX+E2組)，每組10只。OVX+E2組大鼠每天上午(9：00～10：00)連續(xù)8 w腹腔注射0.1 ml(1 mg/ml)苯甲酸E2。

1.2卵巢切除實(shí)驗(yàn)操作 根據(jù)前期學(xué)者的操作〔8〕，大鼠被麻醉后在鼠腰椎處做縱行切口(1 cm)，結(jié)扎輸卵管及血管，隨后切除雙側(cè)卵巢(SHAM組操作步驟相同，但不切除卵巢，只切除腹腔中一小塊脂肪)。所有大鼠術(shù)后肌注青霉素3 d。

1.3八臂迷宮實(shí)驗(yàn)(ERM) 所有大鼠在E2治療8 w后進(jìn)行ERM。實(shí)驗(yàn)前大鼠先適應(yīng)迷宮環(huán)境，然后進(jìn)行八臂迷宮訓(xùn)練(2次/d)。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠置于迷宮中央，然后將通往八臂的鼠門(mén)關(guān)注，八臂中2、4、6、8號(hào)臂放置餌料，然后將鼠門(mén)打開(kāi)并開(kāi)啟迷宮分析軟件，測(cè)試時(shí)間10 min。記錄指標(biāo)包括工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)(WME)，參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)(RME)，總記憶錯(cuò)誤次數(shù)(TE)；當(dāng)大鼠將4臂食物吃完或10 min鐘后，實(shí)驗(yàn)結(jié)束，記錄所需時(shí)間(TT)。

1.4海馬nNOS取材、切片與染色 腹腔注射戊巴比妥鈉(100 mg/kg)深度麻醉大鼠，多聚甲醛(4%，150 ml)常規(guī)心臟灌注，開(kāi)顱取出腦組織，30%蔗糖溶液后固定。然后將腦組織連續(xù)冠狀切片，片厚30 μm，將切片入3%甲醇雙氧水溶液室溫孵育30 min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，37℃孵育20 min，隨后滴加nNOS血清第一抗體100 μl(兔抗大鼠，1∶50)，孵育及磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后加入生物素標(biāo)記的羊抗兔第二抗體50 μl，孵育2 h后，DAB顯色，酒精脫水，透明，封片。

1.5海馬nNOS圖像分析 參照大鼠腦立體定位圖譜隨機(jī)選取海馬相同區(qū)域的5個(gè)視野，400倍物鏡下由光學(xué)顯微鏡拍攝海馬nNOS的表達(dá)，利用形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)測(cè)量海馬nNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及面積。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試結(jié)果比較 與SHAM組比較，OVX組TT顯著延長(zhǎng)(P<0.01)，延長(zhǎng)幅度為44.57%；WME、RME及TE均顯著增加(P<0.01)。給予E2替代治療8 w能夠明顯逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象，與OVX組比較，OVX+E2組TT顯著縮短(P<0.01)，下降幅度為33.25%；WME、RME及TE均顯著減少(P<0.01)。這一結(jié)果提示，E2治療可顯著改善OVX大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。見(jiàn)表1。

表1 各組ERM完成時(shí)間及錯(cuò)誤次數(shù)比較

與SHAM組比較：1)P<0.01；與OVX組比較：2)P<0.01

2.2各組大鼠海馬nNOS免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量、面積結(jié)果比較 光鏡下海馬分布有大量nNOS，神經(jīng)元染色為棕黃色，突起明顯。

與SHAM組比較，OVX組海馬nNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(P<0.05)及面積(P<0.01)均顯著降低，降低幅度分別為32.67%及48.03%；OVX+E2組海馬nNOS表達(dá)無(wú)顯著變化(P>0.05)；經(jīng)過(guò)8 w E2治療，OVX+E2組與OVX組比較，海馬nNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及面積均顯著增高(P<0.01)，增加幅度分別為74.26%及96.72%。見(jiàn)圖1，表2。

圖1 海馬nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元分布(免疫組織化學(xué)染色，×400)

表2 各組海馬nNOS免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及面積比較

與SHAM組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；與OVX組比較：3)P<0.01

3 討 論

有越來(lái)越多的證據(jù)顯示，大腦中雌激素水平不僅與生殖相關(guān)的神經(jīng)內(nèi)分泌活動(dòng)有關(guān)，而且可以調(diào)節(jié)大腦的功能，如情緒、記憶及認(rèn)知等〔9〕。流行病學(xué)研究表明，絕經(jīng)后女性雌激素缺失可能會(huì)增加以認(rèn)知功能下降為主要表現(xiàn)的疾病的發(fā)生，如AD〔10〕。通過(guò)衰老及雌激素剝奪大鼠發(fā)現(xiàn)，雌激素缺乏可影響嚙齒動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力，包括空間參考記憶、空間工作記憶和非空間學(xué)習(xí)記憶。Wilson等〔11〕研究認(rèn)為，短期雌激素剝奪對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶能力沒(méi)有影響，而超過(guò)4～5 w的雌激素剝奪可削弱大鼠認(rèn)知功能〔12〕，因此，本實(shí)驗(yàn)測(cè)試雌激素剝奪8 w大鼠的認(rèn)知功能，表現(xiàn)為OVX大鼠完成八臂迷宮時(shí)間顯著延長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加，與前期學(xué)者研究結(jié)果一致〔13〕。雌激素可影響認(rèn)知功能，F(xiàn)rick等〔14〕通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)證實(shí)，27月齡老年小鼠連續(xù)注射E2 5 d可顯著改善小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，而Plamondon等〔15〕給予OVX腦缺血大鼠連續(xù)注射E2(100 μg/kg)15 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著改善；另外，研究證實(shí)E2可以預(yù)防與年齡相關(guān)的認(rèn)知能力下降，并且可改善OVX大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力〔16〕。本實(shí)驗(yàn)可以證明雌激素替代可改善卵巢摘除對(duì)認(rèn)知功能的影響，然而有些研究認(rèn)為雌激素替代治療對(duì)認(rèn)知功能損害沒(méi)有重大影響，如Chesler等〔17〕認(rèn)為雌激素或孕激素對(duì)OXV大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力均沒(méi)有顯著影響。因此，雌激素替代治療是否有利于認(rèn)知功能的改善還需進(jìn)一步研究。

NO可以調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)及記憶過(guò)程，包括抑制(被動(dòng))逃避學(xué)習(xí)、空間記憶學(xué)習(xí)及嗅覺(jué)學(xué)習(xí)〔18〕。Majlessi等〔19〕認(rèn)為海馬NO的合成對(duì)大鼠空間記憶的形成或許是一個(gè)很關(guān)鍵的因素，給予大鼠NOS阻滯劑可以削弱大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力〔20〕。大腦NO含量和NOS活性與腦衰老關(guān)系密切〔21〕，nNOS/NO在學(xué)習(xí)獲得階段具有重要作用，因此可以認(rèn)為衰老大鼠NO產(chǎn)生不足可能參與大鼠認(rèn)知功能的衰退〔22〕。另一方面，海馬是動(dòng)物學(xué)習(xí)和記憶的中心，由nNOS催化產(chǎn)生的NO對(duì)海馬依賴的學(xué)習(xí)和記憶很重要。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OVX大鼠海馬nNOS表達(dá)顯著減少，說(shuō)明海馬NO對(duì)學(xué)習(xí)和記憶有明顯的調(diào)控作用；而且，OVX大鼠認(rèn)知功能下降至少部分是由于損害海馬nNOS神經(jīng)元導(dǎo)致NO生成減少所致，而OVX大鼠長(zhǎng)期注射E2改善學(xué)習(xí)記憶能力可能與海馬nNOS表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)，但是海馬nNOS增強(qiáng)的機(jī)制仍不清楚。E2可增加NO的釋放，增加NOS各亞型蛋白的表達(dá)及增加各組織NOS的活性〔23〕。而Nobakht等〔24〕認(rèn)為雌激素受體可以增加海馬nNOS的活性。并且Zhang等〔25〕發(fā)現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)由nNOS催化產(chǎn)生的NO可激活NMDA受體，從而引發(fā)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)和突觸可塑性，從而增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力。因此，可以推測(cè)E2增加OVX大鼠海馬nNOS活性催化產(chǎn)生的NO可能是雌激素神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制之一，具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。