左西孟旦對(duì)擴(kuò)張型心肌病的作用及機(jī)制

袁文金 李文峰 羅剛 張丹丹 王誠(chéng)高 劉羅英 羅駿

(贛州市人民醫(yī)院心內(nèi)科，江西 贛州 341000)

擴(kuò)張型心肌病(DCM)是一種以心腔〔右心室和(或)左心室〕擴(kuò)大、心肌乏力、射血功能障礙為主要特征的原因不明的心肌疾病，至今尚無(wú)特別有效性治療方法，預(yù)后極不理想，5年生存率未到50%，發(fā)病率在我國(guó)日趨增高〔1，2〕。研究發(fā)現(xiàn)，Lamin A/C核纖層蛋白(LMNA)基因突變是確定的DCM的致病因素〔3,4〕。LMNA基因位點(diǎn)82位谷氨酸突變成賴氨酸(E82K)突變有促使細(xì)胞具有幼稚化的轉(zhuǎn)變傾向,這可能是導(dǎo)致DCM的原因之一〔5,6〕。另有研究表明，DCM與心臟鈉通道蛋白(SCN)5A突變直接相關(guān)〔7〕。左西孟旦作為一種治療心力衰竭的新型藥物，主要以增強(qiáng)心肌對(duì)Ca2+的反應(yīng)性而發(fā)揮作用，還具有一定的抗氧化、抗炎、抗心肌細(xì)胞凋亡作用〔8～10〕。目前，較少有左西孟旦發(fā)揮治療心力衰竭具體作用的機(jī)制研究，本研究旨在探索左西孟旦對(duì)DCM的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 HCM細(xì)胞系本室保存;LMNA siRNA購(gòu)自Santa Cruz;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物購(gòu)自Invitogen公 司 ;MTT粉末購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;胎牛血清(FBS)和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自康寧公司;左西孟坦購(gòu)自上海匯瑞生物科技有限公司。LMNA抗體(Santa Cruz)；HRP-anti-Rab(聯(lián)科)；PCR儀(ABI);光學(xué)顯微鏡(Olympus);低溫離心機(jī)(Thermo);凝膠成像儀(GE);電泳儀(Bio-Rad);照相機(jī)(Canon);旋轉(zhuǎn)混合儀(寧波新芝生物科技有限公司);微波(Galanz);超純水系統(tǒng)(Millipore)；超速離心機(jī)(Beckman);制冰機(jī)(北京長(zhǎng)流科學(xué)儀器有限公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 人心肌細(xì)胞系HCM細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基加入10%FBS進(jìn)行體外培養(yǎng)。加入100 μg/ml的青霉素和100 μg/ml的鏈霉素,5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前將HCM細(xì)胞傳代6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染反義干擾核糖核酸(siRNA ctrl組)、反義干擾LMNA的核糖核酸(si-LMNA組)，轉(zhuǎn)染si-LMNA同時(shí)加入左西孟旦(si-LMNA+左西孟旦組)。當(dāng)細(xì)胞覆蓋率在80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,實(shí)驗(yàn)步驟完全按照 Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑操作說(shuō)明進(jìn)行,轉(zhuǎn)染48 h。

1.4細(xì)胞存活能力實(shí)驗(yàn) 待測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，在 96孔板中每孔加入200 μl細(xì)胞懸液，約4 000個(gè)細(xì)胞，每組6個(gè)復(fù)孔，24 h后加藥刺激24 h，每孔加入20 μl噻唑藍(lán)(MTT)溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。 棄培養(yǎng)液后每孔加入150 μl二甲基亞砜溶液，置于室溫?fù)u床低速振蕩10 min，在酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。

1.5LMNA基因SCN5A蛋白檢測(cè) 收集細(xì)胞分別提取LMNA RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA做定量多聚酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測(cè)，提取SCN5A蛋白，Western印跡法檢測(cè)蛋白水平變化。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1LMNA基因沉默 si-LMNA組LMNA基因表達(dá)明顯降低。見(jiàn)圖1。

圖1 LMNA基因沉默后HCM細(xì)胞中LMNA基因表達(dá)變化

2.2MTT細(xì)胞生存率實(shí)驗(yàn) siRNA ctrl組HCM細(xì)胞生存率(71%±51%)和si-LMNA+左西孟旦組HCM細(xì)胞生存率(62%±34%)均顯著高于si-LMNA組(48%±47%)(P<0.05)。LMNA基因沉默降低了HCM細(xì)胞的生存率，加入左西孟旦后細(xì)胞生存率可逆轉(zhuǎn)提高。

2.3LMNA基因沉默后SCN5A基因轉(zhuǎn)錄的變化及左西孟旦的作用 siRNA ctrl組SCN5A基因表達(dá)(1.00±0.62)和si-LMNA+左西孟旦組SCN5A基因表達(dá)(0.62±0.30)均顯著高于si-LMNA組(0.38±0.14，P<0.05)。

2.4LMNA基因沉默后SCN5A水平的變化及左西孟旦的作用 LMNA基因沉默可顯著抑制SCN5A表達(dá)(si-RNA組)，加入左西孟旦后可顯著恢復(fù)SCN5A表達(dá)(si-RNA+左西孟旦組)。見(jiàn)圖2。

圖2 LMNA基因沉默后SCN5A表達(dá)變化

3 討 論

DCM的主要特征表現(xiàn)為心腔擴(kuò)大造成室壁受壓變薄 ，從而易發(fā)心律失常，后期常常形成難治性心力衰竭、甚至猝死〔11〕。目前臨床上暫無(wú)有效的醫(yī)療手段，因此該病的死亡率較高。學(xué)界普遍認(rèn)為基因缺陷、免疫因素和病毒感染是誘發(fā)DCM的三個(gè)主要病因，遺傳因素在其中約占1/3。在DCM已確定的致病基因中，LMNA 基因突變或缺失是導(dǎo)致DCM比較重要的因素〔12〕。LMNA 基因區(qū)間定位于Ⅰ號(hào)染色體長(zhǎng)臂的2區(qū)I帶，包含12個(gè)外顯子，10號(hào)外顯子上選擇性剪接產(chǎn)生兩種mRNA,分別編碼 lamin A 蛋白和 lamin C 蛋白，這兩種蛋白與 LMNB 基因編碼的 lamin B 蛋白共同組成細(xì)胞核的核纖層。核纖層是由核纖層蛋白單體多聚組裝而成的近四邊形的蛋白網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，緊靠在內(nèi)層核膜的內(nèi)表面，它與中等纖維蛋白家族具有高度的同源性，在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、提供染色體錨著位點(diǎn)、維持核膜完整性及在核周期性解體與重組過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用〔13〕。 LMNA 基因缺失的細(xì)胞，在細(xì)胞核形態(tài)上表現(xiàn)異常且對(duì)機(jī)械物理的牽引力降低，造成胞核脆弱值增加，更容易自身破裂。在致DCM的LMNA 基因的突變位點(diǎn)中,Gupta等〔14〕證明3R77H，E161K突變會(huì)導(dǎo)致腸 minA 蛋白單體不能正確聚合成核纖層蛋白。雖然有以上研究發(fā)現(xiàn)，但對(duì) LMNA 基因突變功能的研究結(jié)果都難以徹底解釋其致DCM的作用機(jī)制,這很可能存在其他未發(fā)現(xiàn)的機(jī)制在致DCM中起作用。綜合來(lái)說(shuō)，學(xué)界目前對(duì)DCM發(fā)病的作用機(jī)制尚無(wú)比較完善的認(rèn)知,也暫時(shí)找不到有效的治療方法，只能在現(xiàn)有的醫(yī)療認(rèn)識(shí)和手段下對(duì)癥治療，極難徹底治愈DCM。

一些相關(guān)心臟類疾病的發(fā)病與基因變異所引起的離子通道異常有著某種關(guān)系，基因變異過(guò)程中編碼相應(yīng)離子通道的蛋白結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，進(jìn)而引發(fā)致死性心臟功能紊亂〔15〕。在目前報(bào)道中，此類異常有鉀離子通道疾病和鈉離子通道疾病等，這類特征的疾病主要含有：兒茶酚胺敏感多態(tài)性室速(CPVT)、Brugada綜合征(BS)、長(zhǎng)QT綜合征(LQTS)和短QT綜合征(SQTS)?，F(xiàn)有的案例和實(shí)驗(yàn)研究表明，嬰兒猝死綜合征、青壯年猝死綜合征的發(fā)生均與 SCN5A 基因變異引起的心肌鈉離子通道異常有關(guān)〔16〕。SCN5A 基因編碼心臟Na+通道的成孔亞單位，負(fù)責(zé)心臟動(dòng)作電位的迅速除極，在控制心肌細(xì)胞興奮的維持和傳導(dǎo)中起著決定作用。大量臨床研究表明 SCN5A 的突變可誘發(fā)多種致死性心律失?！?7,18〕?，F(xiàn)有的案例和實(shí)驗(yàn)研究表明，由SCN5A基因突變誘發(fā)的心律異常按照Na+通道功能變化通常分為兩類，一類是功能減低型突變，包括BS，心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)疾病如病態(tài)竇房結(jié)綜合征；另外一類是功能增強(qiáng)型突變?nèi)鏛QTS Ⅲ型等〔19,20〕。目前SCN5A 已成為法醫(yī)病理學(xué)研究和心臟分子遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)，大量心臟電生理學(xué)研究證實(shí)，青壯年猝死發(fā)生的重要病因是 SCN5A 基因突變引起致死性心律失常。另外，也有研究表明 SCN5A 基因的某些常見(jiàn)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(SNP)變異也會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞Na+通道發(fā)生改變，從而提高患者心律失常發(fā)生率〔21,22〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，LMNA 基因?qū)?SCN5A 基因蛋白水平的調(diào)節(jié)起著比較重要的作用，左西孟旦的使用很可能通過(guò)逆轉(zhuǎn) LMNA 基因缺陷來(lái)調(diào)節(jié)SCN5A 的基因蛋白水平，實(shí)現(xiàn)對(duì)DCM的治療作用。