miR-23b通過MAPK信號通路對H2O2誘導的血管內皮細胞損傷的保護作用

陳德才 王雅 馬從乾 楊軻 陳輝 陳德霞

(鄭州大學附屬南陽市中心醫(yī)院 1血管外科，河南 南陽 473200；2腎內科；3南陽市方城縣人民醫(yī)院血液凈化科)

高血壓、冠心病等多種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展與血管內皮細胞受損密切有關，血管內皮損傷導致血栓的形成是多種心血管疾病的病理基礎〔1〕。氧化應激、氧化低密度脂蛋白、腎素-血管緊張素系統、同型半胱氨酸等多種因素都可以影響血管內皮細胞損傷〔2〕。氧化應激通過促進炎癥細胞的生長，促進內皮細胞凋亡，促進炎癥因子過表達，降解細胞外基質等方式損傷血管內皮細胞〔3〕。氧化應激造成的血管內皮細胞損傷是由活性氧(ROS)介導的，ROS可以調節(jié)胞質內鈣離子濃度及一氧化氮(NO)的生成，減弱血管舒張，導致血管內皮受損〔4〕。microRNA(miR)非編碼RNA可調控多種信號通路，參與細胞增殖、分化、凋亡及黏附等過程，并參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔5,6〕。目前研究顯示，miR可調控血管內皮細胞增殖、凋亡、分化及血管形成等生理病理過程。miR-23b可通過調控核因子(NF)-κB信號通路，調節(jié)相關炎癥因子和細胞因子的表達起到自身免疫作用〔7〕。最近研究發(fā)現，通過生物信息學的手段對miR-23b相關靶基因通路進行分析發(fā)現，miR-23b可調控Notch信號通路、Wnt/c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路等，對其作用的靶基因的功能進行分類，主要包括調控細胞增殖、細胞凋亡、細胞分化、參與免疫調節(jié)、促進血管形成、介導炎癥反應等功能〔8～10〕。本研究探討miR-23b對血管內皮細胞損傷保護作用與MAPK信號通路的相關性。

1 材料與方法

1.1材料 人血管內皮細胞(HUVECs)株購自美國ATCC公司，試劑：胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Sigma公司；Lipofectamine2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；miR-23b mimic及miR-23b-mimic陰性對照購自上海GnenPharma公司；白細胞介素(IL)-1β(PeproTech，美國)；RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒購自美國Promega公司；SYBR Green Gene Expression Assay購自大連Takara公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自南京森貝伽生物公司；丙二醛(MDA)試劑盒、過氧化物歧化酶(SOD)試劑盒及乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒均購自北京博奧森生物公司；實驗所用引物均由上海生工合成；p38-MAPK抗體、p-p38抗體、Bax抗體、酶切(Cleaved)Caspase-3抗體、辣根過氧化物標記的二抗均購自美國Abcam公司。

1.2血管內皮細胞的培養(yǎng)和分組 血管內皮細胞接種于杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)中，于37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%的胰蛋白酶進行消化傳代，取生長良好的細胞用于實驗。實驗分為四組，空白(Blank)組：不做任何處理正常培養(yǎng)的血管內皮細胞；H2O2組：在細胞培養(yǎng)液中加入H2O2，調整其終濃度為0.1 mmol/L，建立血管內皮細胞氧化應激損傷模型；miR-23b-mimic+H2O2組：血管內皮細胞轉染miR-23b mimic后加入終濃度為0.1 mmol/L H2O2處理；mimic-nc+H2O2組：血管內皮細胞轉染miR-23b mimic陰性對照后加入終濃度為0.1 mmol/L H2O2處理。轉染具體步驟按照Lipofectamine2000轉染試劑說明書進行操作。處理后置于7℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3qRT-PCR檢測HUVECs miR-23b表達 各組細胞分別培養(yǎng)24 h以后，分別收集細胞，按照每10 cm2的細胞加入1 ml的Trizol，裂解各組血管內皮細胞，再加入1/5體積的氯仿溶液，混勻后劇烈震蕩15 s，4℃下12 000 r/min離心10 min。取上清液至另一新的EP管，用預冷的異丙醇沉淀RNA，用75%的乙醇洗滌RNA，最后用RNase-free ddH2O溶解RNA。經純度和濃度檢測后，用M-MLV逆轉錄試劑盒合成cDNA，用SYBR Green Gene Expression Assay進行熒光定量PCR擴增，采用20 μl反應體系(cDNA 2 μl、正義鏈0.5 μl、反義鏈0.5 μl、2× SYBR Green qPCR Master Mix 10 μl、ddH2O 7 μl)。以β-actin為參照，用相對定量2-△△CT計算miR-23b相對表達量。引物：GAPDH-正義5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，反義5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′；miR-23b-正義5′-TGGGTTCCTGGCATGC-3′，反義5′-TCGTATCCAGTGCAGGGTC-3′。

1.4流式細胞術檢測HUVECs凋亡情況 各組血管內皮細胞以上述方法處理后培養(yǎng)24 h，用胰蛋白酶進行消化，收集細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)將各組細胞洗滌2次后，加入約400 μl的結合緩沖液混勻，吹打制成單細胞懸液，再依次加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，輕柔混勻后置于室溫中避光孵育15 min，用流式細胞儀測定凋亡情況。

1.5Western印跡檢測細胞中p38-MAPK、p-p38、Cleaved Caspase-3、Bax水平 各組HUVECs分別培養(yǎng)24 h以后，每孔細胞中加入適量苯甲基磺酞氟(PMSF)裂解液，置冰上孵育約20 min。用細胞刮將細胞刮落，收集到離心管中，4℃下12 000 r/min離心10 min。采用二喹啉甲酸(BAC)法對蛋白進行定量。每個泳道加入40 μg蛋白樣品進行電泳，采用5%的濃縮膠和10%的分離膠，濃縮膠的電流為20 mA，分離膠的電流為40 mA，當指示劑電泳至凝膠底部時停止。采用半干法進行轉膜，在4℃條件下以80 V電壓轉膜90 min。將硝酸纖維素膜放入5%牛血清白蛋白中，室溫下在搖床上封閉60 min。分別加入p38-MAPK(1∶800稀釋)、p-p38(1∶800稀釋)、Cleaved Caspase-3(1∶1 000稀釋)、Bax(1∶500稀釋)一抗4℃過夜孵育，再加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，在室溫下孵育2 h。采用電化學發(fā)光(ECL)試劑盒進行顯影，用成像系統進行掃描，用軟件分析各組細胞中p38-MAPK、p-p38、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平。

1.6檢測血管內皮細胞中過氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)活性 上述方法處理細胞后24 h，收集細胞，1 000 r/min離心10 min，去掉上清培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，用PBS重懸各組細胞，通過超聲波細胞破碎儀冰浴中破碎5 s×5次，使細胞破碎，黃嘌呤氧化酶法檢測血管內皮細胞中SOD活性，硫代巴比妥酸法檢測血管內皮細胞中MDA含量，比色法檢測血管內皮細胞中LDH活性。

1.7MAPK信號通路激活劑上調miR-23b的表達對H2O2誘導的HUVECs的影響 在轉染后H2O2誘導處理HUVECs 24 h后，加入10 μmol/L的MAPK激活劑茴香霉素處理記為Anisomycin組。用流式細胞術測定48 h HUVECs凋亡情況，步驟同1.4。蛋白質印跡法測定48 h細胞中p38-MAPK、p-p38、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平，步驟同1.5。檢測48 h血管內皮細胞中SOD、MDA、LDH活性，步驟同1.6。

1.8統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1qRT-PCR檢測HUVECs miR-23b表達 H2O2組HUVECs miR-23b水平(0.64±0.07)明顯低于Blank組(1.00±0.00)(P<0.05)，miR-23b-mimic+H2O2組miR-23b水平(3.21±0.28)明顯高于mimic-nc+H2O2組(0.62±0.06)(P<0.05)，mimic-nc+H2O2組細胞內miR-23b水平與H2O2組無明顯變化(P>0.05)；4組差異有統計學意義(F=212.560,P=0.000)。

2.2miR-23b上調減少H2O2誘導的血管內皮細胞凋亡 與Blank組相比，H2O2組血管內皮細胞凋亡率明顯升高，細胞中Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平顯著上調(P<0.05)。與H2O2組相比，miR-23b mimic+H2O2組細胞凋亡率和細胞中Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平明顯降低(P<0.05)，H2O2組與mimic-nc+H2O2組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。提示H2O2誘導血管內皮細胞凋亡，而上調miR-23b可減少H2O2誘導的血管內皮細胞凋亡，減少細胞中Caspase-3活化，減少Bax表達。見圖1和表1。

2.3miR-23b上調減少H2O2誘導的血管內皮細胞氧化損傷 與Blank組相比，H2O2組血管內皮細胞中SOD活性顯著降低，MDA含量和LDH活性顯著升高(P<0.05)；與mimic-nc+H2O2組相比，miR-23b mimic+H2O2組血管內皮細胞中SOD活性顯著升高，MDA含量和LDH活性顯著降低(P<0.05)；mimic-nc+H2O2組與H2O2組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。說明H2O2誘導血管內皮細胞發(fā)生氧化損傷，上調miR-23b可以緩解H2O2誘導的血管內皮細胞的損傷。見表1。

2.4MAPK信號通路激活劑對血管內皮細胞中p38-MAPK、p-p38的影響 與H2O2組相比，miR-23b mimic+H2O2組細胞中p38-MAPK和p-p38的表達水平明顯降低(P<0.05)。與miR-23b mimic+H2O2組相比，Anisomycin組細胞中p38-MAPK和p-p38的表達水平明顯升高(P<0.05)。說明上調miR-23b可以抑制p38-MAPK和p-p38表達，抑制MAPK信號通路激活，加入MAPK信號通路激活劑后可以上調p38-MAPK和p-p38表達，激活MAPK信號通路。見圖2，表2。

圖1 miR-23b對H2O2誘導的血管內皮細胞凋亡及對細胞中Cleaved Caspase-3、Bax表達的影響

表1 各組血管內皮細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平及SOD、MDA和LDH活性比較

1)與Blank組比；2)與mimic-nc+H2O2組比:均P<0.05

2.5MAPK信號通路激活劑對血管內皮細胞損傷的影響 與H2O2組相比，miR-23b mimic+H2O2組細胞中SOD活性顯著升高，MDA含量和LDH活性顯著降低(P<0.05)。與miR-23b mimic+H2O2組相比，Anisomycin組細胞中SOD活性顯著降低，MDA含量和LDH活性顯著升高(P<0.05)。上調miR-23b可以降低H2O2誘導的血管內皮細胞損傷，而MAPK激活劑可以增加上調miR-23b降低的血管內皮細胞的損傷。見表2。

圖2 Western印跡檢測各組血管內皮細胞中p38-MAPK和p-p38的表達水平

表2 各組血管內皮細胞中p38-MAPK、p-p38表達及SOD、MDA和LDH活性比較

與H2O2組比：1)P<0.05；與miR-23b mimic+H2O2組比：2)P<0.05

3 討 論

血管內皮細胞結構與功能的損傷是高血壓、冠心病等心血管疾病發(fā)生的起始環(huán)節(jié)，而活性氧(ROS)的產生和清除失衡參與了血管內皮細胞的損傷過程。過量ROS產生會導致中性粒細胞炎性浸潤，產生大量氧化中間物，引起蛋白氧化損傷，導致細胞發(fā)生氧化損傷〔11〕。SOD是生物體內非常重要的抗氧化酶，廣泛存在于動物、植物、微生物中，是清除體內ROS的首要物質。SOD活性的高低是反映機體抗氧化損傷能力的直觀指標，可緩解細胞的氧化損傷并可修復受損細胞〔12〕。MDA是膜脂過氧化主要產物之一，MDA含量增多可加劇膜的損傷。通過MDA含量的高低可反映膜脂過氧化的程度，膜系統受損程度可反映細胞受損程度〔13〕。LDH幾乎在所有組織中都存在，在心肌梗死、白血病、腎臟疾病、溶血性貧血等疾病LDH含量增高。當細胞膜受損時，細胞外液中的LDH滲出，導致LDH含量增多，因此，LDH含量可反映細胞損傷程度〔14〕。本實驗結果說明H2O2可誘導血管內皮細胞發(fā)生氧化損傷。上調miR-23b后，血管內皮細胞SOD活性升高，MDA含量和LDH活性降低，說明上調miR-23b可緩解H2O2誘導的氧化損傷。

近年來研究證實，miRNA可作為一類信號調節(jié)物質通過調控靶基因及相關信號通路參與多種物種的生命過程，參與調控細胞增殖、分化、凋亡及組織器官的代謝和發(fā)育等過程〔15,16〕。miR-23b定位于人9號染色體上，在胰腺癌、肝癌等多種腫瘤中異常表達，發(fā)揮抑癌基因或癌基因的作用〔17〕。研究發(fā)現，上調miR-23b表達能夠抑制3T3-L1前脂肪細胞增殖，促進3T3-L1前脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞〔18〕。在哮喘小鼠的氣道平滑肌組織中miR-23b表達量比正常小鼠低，氣道平滑肌細胞過度增殖，凋亡減少與miR-23b的表達下降有關〔19〕。由激素誘導的骨微血管內皮細胞損傷可導致miR-23b表達發(fā)生明顯的變化，miR-23b可調控相關靶基因的轉錄和表達調控細胞凋亡及血管形成，最終影響激素誘導的股骨頭壞死的病理發(fā)展過程〔20〕。目前研究顯示，Cleaved Caspase-3和Bax是介導細胞發(fā)生凋亡的標志性指標，Caspase的活化可引起細胞內DNA內切酶活性增加對DNA進行剪切，引起細胞凋亡。Bax的表達升高可引起B(yǎng)ax/Bcl-2比例上升，引起細胞凋亡〔21,22〕。本實驗結果說明miR-23b通過影響凋亡相關蛋白Cleaved Caspase-3和Bax的表達來調控血管內皮細胞凋亡的過程。

在前列腺癌細胞中，miR-23b能夠調控第10號染色體同源缺失性磷酸酶張力蛋白(PTEN)的表達，影響磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路中關鍵信號因子的表達，促進前列腺癌細胞增殖〔23〕。血管內皮細胞在血流剪切力下觀察細胞的生物學特性實驗中發(fā)現，miR-23b與MAPK信號通路之間存在回饋調節(jié)作用〔24,25〕。本實驗結果說明miR-23b可減少細胞損傷，降低血管內皮細胞凋亡。miR-23b的表達上調，與MAPK信號通路相關蛋白p38-MAPK和p-p38表達降低，提示miR-23b可抑制MAPK信號通路的激活。加入MAPK信號通路激活劑，可增加上調miR-23b表達抑制H2O2誘導血管內皮細胞的損傷。以上結果說明miR-23b可通過抑制MAPK信號通路的激活抑制細胞損傷和凋亡，對H2O2誘導血管內皮細胞損傷起保護作用。

miR-23b參與血管內皮細胞凋亡和損傷保護的過程，其作用機制與MAPK信號通路的激活有關，在血管內皮損傷引起的心血管疾病發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用，為心血管疾病預防和治療提供新的切入點。