甲狀腺乳頭狀癌組織中ZNF703、CD44v6的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

徐振宇 白文忠 李廣平

(唐山市工人醫(yī)院 1醫(yī)務(wù)科,河北 唐山 063000;2耳鼻喉科;3檢驗(yàn)科)

甲狀腺癌是一種常見的內(nèi)分泌器官惡性腫瘤，甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌中最常見的一種類型〔1〕，約占甲狀腺癌的70%，在我國沿海及高碘攝入地區(qū)，其比例已達(dá)90%以上〔2〕，并且甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)〔3，4〕。鋅指蛋白(ZNF)703基因位于染色體8區(qū)域〔5〕。國內(nèi)外許多研究發(fā)現(xiàn)ZNF703在人大腸癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等腫瘤中均有較高水平表達(dá)〔6～9〕，發(fā)揮致癌作用，且ZNF703高表達(dá)提示預(yù)后較差。CD44v6是一種細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，其出現(xiàn)會(huì)使腫瘤細(xì)胞表面黏附分子的結(jié)構(gòu)和功能改變，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。甲狀腺乳頭狀癌早期可能發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，現(xiàn)有的影像學(xué)方法較難發(fā)現(xiàn)早期頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌，待其發(fā)展至影像學(xué)可見，多已突破淋巴結(jié)包膜，此時(shí)療效及預(yù)后均會(huì)有所降低。關(guān)于ZNF703和CD44v6在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)水平的報(bào)道較少，因此本研究檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌組織中ZNF703和CD44v6的表達(dá)水平及與臨床特征的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 選取2016年12月至2018年2月唐山市工人醫(yī)院行甲狀腺切除術(shù)患者的手術(shù)標(biāo)本，甲狀腺乳頭狀癌組織73例、配對(duì)癌旁正常甲狀腺組織73例(取材處距離癌組織邊緣≥5 cm，術(shù)后病理確認(rèn)為正常組織)、結(jié)節(jié)性甲狀腺瘤組織50例甲狀腺乳頭狀癌組26例男性，47例女性，平均年齡(56.36±9.84)歲，腫瘤直徑≤4 cm者 42例，直徑>4 cm者31例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者32例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者41例；依據(jù)AJCC癌癥分期手冊(cè)第七版標(biāo)準(zhǔn)〔10〕：臨床分期Ⅰ～Ⅱ期 45 例，Ⅲ～Ⅳ期28例。結(jié)節(jié)性甲狀腺癌組17例男性，33例女性，平均年齡(55.21±13.07)歲。甲狀腺乳頭狀癌組及癌旁組患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷經(jīng)病理證實(shí)，符合AJCC癌癥分期手冊(cè)第七版標(biāo)準(zhǔn)〔10〕；②初次甲狀腺手術(shù)；③相關(guān)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前接受過放療、化療；②患有橋本甲狀腺炎及乳腺、子宮相關(guān)疾??；③有其他惡性腫瘤病史。參與本實(shí)驗(yàn)的所有患者知情同意并簽署知情同意書，且獲本院倫理委員會(huì)同意。

1.2主要試劑 兔抗人抗體ZNF703購于美國Abcam公司，鼠抗人單抗CD44v6、通用型IgG、SP試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3免疫組化過程 實(shí)驗(yàn)采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(SP)法，將所有標(biāo)本蠟塊切成4 μm厚，將切片置于68℃烤片機(jī)烤20 min，經(jīng)二甲苯脫蠟后，梯度酒精脫水；3%過氧化氫(H2O2)孵育，磷酸鹽緩沖液(PBS)液沖洗；抗原修復(fù)；血清工作液封閉30 min后，切片分別滴加ZNF703 (1∶100)、CD44v6(1∶200)，PBS陰性對(duì)照，4℃孵育過夜；通用型IgG及DAB顯色試劑盒均參照說明書操作；脫水、干燥、封片。

1.4結(jié)果判定〔8〕ZNF703主要在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，表達(dá)陽性呈棕黃色；CD44v6主要在細(xì)胞膜中表達(dá)，表達(dá)陽性呈棕黃色。每個(gè)免疫組化切片隨機(jī)選取5個(gè)100×視野，取平均值，以陽性細(xì)胞數(shù)百分比和染色反應(yīng)強(qiáng)度兩種方法進(jìn)行評(píng)分。陽性細(xì)胞數(shù)百分比≤10%為0分，10%<陽性細(xì)胞數(shù)百分比≤25%為1分，25%<陽性細(xì)胞數(shù)百分比≤50%為2分，50%<陽性細(xì)胞數(shù)百分比≤75%為3分，陽性細(xì)胞數(shù)百分比>75%為4分。陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度為不顯色或顯色不清為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分。取陽性細(xì)胞數(shù)百分比和染色反應(yīng)強(qiáng)度分值的乘積，0～1分為-，2～4為+，5～8分為，9～12分為，+～為陽性表達(dá)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)。

2 結(jié) 果

2.1免疫組化染色結(jié)果 CD44v6在甲狀腺乳頭狀癌組織中ZNF703的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組〔9(12.32%),χ2=49.912，P=0.000〕及組織〔12例(24.00%)，χ2=24.982，P=0.000〕，CD44v6在癌組織中的陽性表達(dá)率57例(78.08%)依次高于癌旁組〔16例(21.92%)，χ2=46.055，P=0.000〕及結(jié)節(jié)性甲狀腺癌組織〔18例(36.00%)，χ2=22.085，P=0.000〕。

2.2甲狀腺乳頭狀癌組織中ZNF703和CD44v6的陽性表達(dá)率與臨床病理特征的關(guān)系 ZNF703和CD44v6在甲狀腺乳頭狀癌組織中的陽性表達(dá)率均與患者性別、年齡無顯著相關(guān)，與腫瘤直徑、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況顯著相關(guān)(P<0.05)，見表1。

表1 ZNF703和 CD44v6陽性表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

2.3ZNF703和CD44v6在結(jié)節(jié)性甲狀腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 Spearman等級(jí)相關(guān)的檢驗(yàn)結(jié)果顯示，ZNF703和CD44v6在結(jié)節(jié)性甲狀腺癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.722，P=0.000)。

3 討 論

甲狀腺乳頭狀癌組織在光學(xué)顯微鏡下為“明確的濾泡細(xì)胞分化，典型的乳頭狀及濾泡結(jié)構(gòu)，特征性胞核改變的甲狀腺惡性上皮腫瘤”〔11〕。鋅指蛋白是具有指狀結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，存在于真核生物中，參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡及表達(dá)調(diào)控等生命過程〔12〕。ZNF703是新發(fā)現(xiàn)的鋅指蛋白一員，目前已被證實(shí)為乳腺癌致癌因子〔13〕。Yang等〔6〕發(fā)現(xiàn)，使用核糖核酸干擾胃癌SGC7901細(xì)胞中ZNF703的高表達(dá)可減少腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。ZNF703在人體多種器官發(fā)揮癌基因的作用，這提示ZNF703可能為廣譜致癌因子。ZNF703的作用機(jī)制可能與其參與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)，Sircolomb等〔14〕發(fā)現(xiàn) ZNF703 可以抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β受體活性，降低E 鈣黏蛋白的表達(dá)并上調(diào)親遷徙性P120連環(huán)亞蛋白的表達(dá)，以此促進(jìn)細(xì)胞的增殖與遷移，減少細(xì)胞間的黏附作用，癌細(xì)胞的侵襲性將大幅增加。還有研究發(fā)現(xiàn)ZNF703可能對(duì)雌激素存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)，ZNF703通過PI3K-AKT-mTOR經(jīng)典信號(hào)通路，誘導(dǎo)雌激素受體(ER)α下調(diào)〔14，15〕，而ERα高表達(dá)可明顯減緩腫瘤的進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)，ZNF703 在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)明顯高于癌旁組織和結(jié)節(jié)性甲狀腺瘤組織，且與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)，與患者年齡、性別無關(guān)，此結(jié)果與Wang等〔16〕和Ma等〔17〕所得研究結(jié)果一致，這說明ZNF703與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)，對(duì)確定腫瘤分期有一定價(jià)值。CD44是一種整合膜糖蛋白，可連結(jié)細(xì)胞基質(zhì)中的層黏連蛋白和纖維連結(jié)蛋白，也可連接Ⅰ型膠原和透明質(zhì)酸分子，還可與細(xì)胞管架蛋白相結(jié)合，從而造成細(xì)胞形態(tài)和游動(dòng)性改變〔18〕，在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)可參與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移。CD44v6是CD44的變異型，也與腫瘤細(xì)胞的遷移有關(guān)，其機(jī)制可能和參與ras信號(hào)通道的激活過程〔19〕有關(guān)。此外通過對(duì)小鼠胃癌模型研究發(fā)現(xiàn)，CD44v6可調(diào)節(jié)脂肪基質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)重塑，從而增加胃癌惡性表型〔20〕。Gutjahr等〔21〕發(fā)現(xiàn)白血病B細(xì)胞上CD44v6與透明質(zhì)酸具有高度親和力，可促進(jìn)慢性淋巴細(xì)胞白血病的進(jìn)展。本研究結(jié)果表明，CD44v6在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)明顯高于癌旁組織和結(jié)節(jié)性甲狀腺瘤組，且與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)，與患者年齡、性別無關(guān)，與Wu等〔22〕的研究結(jié)果相似，這提示CD44v6有鑒別甲狀腺腫瘤良、惡性的潛能，在提示預(yù)后方面也有重要的臨床價(jià)值。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺乳頭狀癌組織中，ZNF703與CD44v6的表達(dá)呈正相關(guān)。兩種蛋白位于細(xì)胞的不同位置，ZNF703可通過PI3K-AKT-mTOR經(jīng)典信號(hào)通路產(chǎn)生作用〔14，15〕，誘導(dǎo)ERα下調(diào)，而CD44v6可參與ras信號(hào)通道激活〔19〕，通過ras基因傳遞細(xì)胞增殖信號(hào)，這兩種蛋白可能存在協(xié)同作用，其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。