缺血性腦卒中相關(guān)基因篩選和功能分析

胡瑞婷 覃冬華 胡瑞光 馮曉敏

(廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，廣西 南寧 530001)

缺血性腦卒中缺血性腦卒中發(fā)病過程中伴隨著多個(gè)基因的改變，這些基因的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸起到重要的作用〔1，2〕。本文通過分析缺血性腦卒中發(fā)病時(shí)發(fā)生的基因改變，旨在分析該病的外周血基因表達(dá)譜，初步篩選出急性缺血性腦卒中發(fā)病過程中的起重要調(diào)控作用的基因。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本數(shù)據(jù) 從美國國家生物技術(shù)信息中心的Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，以“ischemic stroke”為檢索詞，檢索有關(guān)缺血性腦卒中的基因表達(dá)譜微列陣數(shù)據(jù)。納入排除標(biāo)準(zhǔn)：①數(shù)據(jù)集必須是全基因組的表達(dá)mRNA芯片數(shù)據(jù)；②數(shù)據(jù)是關(guān)于缺血性腦卒中患者和正常人外周血標(biāo)本的結(jié)果；③每個(gè)數(shù)據(jù)集的標(biāo)本量必須大于20個(gè)(例)。

1.2差異表達(dá)基因篩選 采用R3.2.0軟件和Bioconductor中的limma軟件包對(duì)下載的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和Log2轉(zhuǎn)化，在采用t檢驗(yàn)篩選差異表達(dá)基因。差異基因的選擇需同時(shí)滿足以下條件：①組間基因表達(dá)值比較P<0.05；②組間差異表達(dá)倍數(shù)(fold change)>1.0倍。

1.3基因功能注釋和信號(hào)通路分析 將獲得的差異表達(dá)基因輸入DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)在線工具進(jìn)行基因功能分析，包括生物過程(BP)、分子功能(MF)和細(xì)胞組成(CC)三部分，再利用(DAVID)中(KEGG)工具對(duì)這些基因進(jìn)行信號(hào)通路分析，以P<0.05為有顯著意義的基因功能或信號(hào)通路。

1.4蛋白-蛋白互作分析(PPI) 將差異表達(dá)基因輸入在線分析工具STRING10.0 (http：//www.string-db.org/) 對(duì)腦卒中發(fā)病相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)物構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，再使用STRING得到的PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)輸入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化分析，再使用MOCDE插件分析出PPI網(wǎng)絡(luò)中的子網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)每個(gè)基因在的網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)聯(lián)系數(shù)顯示節(jié)點(diǎn)顏色深淺。

2 結(jié) 果

2.1標(biāo)本信息 根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)，檢索到2個(gè)GEO數(shù)據(jù)(GSE22255〔3〕和GSE16561〔4〕)共99個(gè)樣本，分別納入55個(gè)缺血性腦卒中患者外周血標(biāo)本和44個(gè)健康對(duì)照人群外周血標(biāo)本，患者均為發(fā)病時(shí)采集外周血標(biāo)本。其中男47例，女52例，分別采用Affymetrix和Illumina芯片平臺(tái)檢測(cè)。兩個(gè)標(biāo)本的基本資料見表1。

2.2差異表達(dá)基因篩選 以P<0.05，差異倍數(shù)>1倍為條件進(jìn)行篩選，共得到61個(gè)差異表達(dá)基因，分別為：GSE22255得到40個(gè)差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)38個(gè)，下調(diào)2個(gè)；GSE16561得到21個(gè)差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)20個(gè)，下調(diào)1個(gè)；兩個(gè)樣本數(shù)據(jù)中差異表達(dá)前10個(gè)基因均為上調(diào)基因。見表2。

表1 納入標(biāo)本的基本資料

表2 差異表達(dá)倍數(shù)前10個(gè)基因

2.3PPI 使用STRING10.0軟件將61個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行PPI，共得到44個(gè)節(jié)點(diǎn)及95條相互關(guān)系連接線，如圖1所示，人類白細(xì)胞抗原(HLA)-DRB1、肽?；彼崦搧啺访?PADI4)、IgG-Fc片段低親和力受體(FCGR)3B、腫瘤壞死因子(TNF)、細(xì)胞因子信號(hào)抑制物(SOCS)3這5個(gè)基因與其他基因的關(guān)聯(lián)系數(shù)最高；根據(jù)MOCDE的計(jì)算結(jié)果得到一個(gè)子網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)有10個(gè)基因，其中TNF是該子網(wǎng)絡(luò)的核心基因。

2.4基因功能注釋和信號(hào)通路分析 對(duì)兩個(gè)樣本的61個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因功能注釋和信號(hào)通路分析，結(jié)果GO基因功能注釋顯示這些差異表達(dá)基因主要參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、中性粒細(xì)胞趨化生物過程；主要分子功能為化學(xué)因子活性、蛋白結(jié)合、細(xì)胞因子活性等；KEGG通路顯示這些差異表達(dá)基因主要參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎通路、腫瘤壞死因子通路、Toll樣受體通路。見表3。

A：差異表達(dá)基因整體互作網(wǎng)絡(luò)圖，顏色越紅表示基因表達(dá)上調(diào)倍數(shù)越高，綠色表示表達(dá)下調(diào)；B：差異表達(dá)基因整體互作網(wǎng)絡(luò)中的子網(wǎng)絡(luò)圖圖1 缺血性腦卒中差異表達(dá)基因PPI圖

表3 基因功能和信號(hào)通路分析

3 討 論

缺血性腦卒中是由于局部血管梗死，相應(yīng)供血區(qū)域血流灌注不足，從而導(dǎo)致肢體運(yùn)動(dòng)、感覺障礙等相關(guān)臨床癥狀的腦血管疾病〔5〕。調(diào)查顯示，43%～65%的腦卒中患者屬于缺血性腦卒中，是腦卒中的主要類型〔6〕。缺血性腦卒中與其他缺血性疾病類似，其發(fā)病過程是一個(gè)多基因、多步驟、多途徑、多階段相互作用和相互影響的復(fù)雜過程，這是導(dǎo)致該病治療困難，致殘率高、復(fù)發(fā)率高的重要原因〔7〕。因此，從分子水平揭示缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制，成為該病治療的研究熱點(diǎn)〔8〕。生物基因芯片技術(shù)具有快速、高效、大規(guī)模、平行化地檢測(cè)基因表達(dá)的優(yōu)勢(shì)，采用生物信息學(xué)方法分析疾病發(fā)生過程的基因表達(dá)變化，可以為我們更好地理解缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制提供有益的線索〔4〕。

本文發(fā)現(xiàn)61個(gè)基因有較顯著的差異表達(dá)，提示這些基因可能參與了缺血性腦卒中的發(fā)病過程。本文發(fā)現(xiàn)HLA-DRB1、PADI4、FCGR3B、TNF、SOCS3的相互作用在缺血性腦卒中發(fā)病中與其他差異表達(dá)基因關(guān)聯(lián)度最高，提示這個(gè)基因有可能在缺血性腦卒中的病變過程中其主要作用。在這5個(gè)基因中，HLA-DRB1、TNF、FCGR3B、 SOCS3與腦卒中的作用得到了驗(yàn)證，如陳維等〔9〕報(bào)道HLA-DRB1單倍型與缺血性腦卒中的發(fā)生呈易感關(guān)聯(lián)，TNF和SOCS3在腦卒中發(fā)病中的作用已有較多的報(bào)道〔10，11〕，而尚未檢索到PADI4在腦卒中的作用報(bào)道，而且FCGR3B的報(bào)道也較少〔12〕，提示可以對(duì)PADI4和FCGR3B基因進(jìn)行后續(xù)的基礎(chǔ)和臨床驗(yàn)證研究。

目前國內(nèi)尚未有文獻(xiàn)報(bào)道缺血性腦卒中患者外周血發(fā)病過程中差異表達(dá)基因的研究結(jié)果，本文首次報(bào)道了該結(jié)果。然而本文也存在不足之處，首先是研究的標(biāo)本量較小，這與目前發(fā)表的數(shù)據(jù)有關(guān)，如果有更多的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)發(fā)表，則可以將其納入進(jìn)一步分析。其次是本文只分析了缺血性腦卒中患者的結(jié)果，沒有對(duì)不同類型，如急性或慢性缺血性腦卒中患者，血管性或其他原因引起的腦缺血類型進(jìn)行亞組分析，這些都是今后進(jìn)一步的研究方向。

總之，缺血性腦卒中患者外周血發(fā)病過程有多個(gè)基因表達(dá)發(fā)生顯著改變，篩選出來的HLA-DRB1、PADI4、FCGR3B、TNF、SOCS3等基因有望成為今后對(duì)缺血性腦卒中干預(yù)新的研究靶點(diǎn)。對(duì)這些基因在缺血性腦卒中的具體作機(jī)制還未明確，還需要進(jìn)行更深入的實(shí)驗(yàn)研究。