明日葉葉斑病病原菌的生物學特性及室內(nèi)藥效試驗

周潔 郭鳳領(lǐng) 符家平 肖穎 徐繩武 吳金平

摘 要：為了明確明日葉（Angelica keiskei）葉斑病病原菌鏈格孢（Alternaria alternata）的生物學特性而進行了室內(nèi)藥劑篩選，為該病的防治提供理論依據(jù)。以蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北重點實驗室保存的明日葉葉斑病病原菌為材料，對病原菌的生物學特性進行測定，并在室內(nèi)對11種藥劑進行篩選。鏈格孢（Alternaria alternata）菌絲生長致死溫度為55 ℃;適宜pH范圍為8～10;最佳氮源為酵母浸出物，最佳碳源為甘露醇;稀釋1 000倍的60%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑和稀釋2 000倍的32.5%苯甲嘧菌酯懸浮劑對該病原菌抑制率達50%以上。綜合以上結(jié)果，明日葉葉斑病病原菌適宜在弱堿性和富含有機營養(yǎng)的環(huán)境下生長，可選用苯醚甲環(huán)唑和苯甲嘧菌酯作為田間防治藥劑。

關(guān)鍵詞：明日葉;葉斑病;鏈格孢;生物學特性;藥劑篩選

Pathogen biological characteristics and fungicide-screening for leaf spot disease of Angelica keiskei

ZHOU Jie1， GUO Fengling1， FU Jiaping1， XIAO Ying1， XU Shengwu2， WU Jinping1

（1. Hubei Key Laboratory of Vegetable Germplasm Enhancement and Genetic Improvement / Institute of Economic Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， Hubei， China; 2. Xianning Academy of Agricultural Sciences， Xianning 437000， Hubei， China）

Abstract： The experiment was conducted to clarify the biological characteristics and fungicide-screening of Alternaria alternata， the pathogen of leaf spot disease of Angelica keiskei， to provide a theoretical basis for the controlling of the disease. The biological characteristics of A.alternata were determined， and 11 kinds of fungicides on pathogens was screened. The lethal temperature of mycelium growth was 55 ℃; the optimal pH range was 8 to 10; the best nitrogen source was yeast extract， the best carbon source was mannitol; 1 000 times solution of 60% difenoconazole water dispersible granules and 2 000 times solution of 32.5% azoxystrobin suspension showed best inhibition effect， and the mycelial growth inhibition rate exceeded 50%.The pathogen of leaf spot disease of A. keiskei is suitable for growth in a weak alkaline and organic-rich environment. Difenoconazole and azoxystrobin can be used as control agents in field.

Key words： Angelica keiskei; Leaf spot; Alternaria alternata; Biological characteristics; Fungicide-screening

明日葉（Angelica keiskei），又名明日草、八丈草、長壽草等，是多年生草本植物，屬傘形科當歸屬的藥食兩用蔬菜，有“21世紀健康食品”和“神奇植物”的美稱[1]。明日葉原產(chǎn)于日本八丈島，含有人體所需的多種維生素、氨基酸、礦物質(zhì)和微量元素等，同時還含有查爾酮、類黃酮及香豆素等天然活性成分，利于人體健康[2- 3]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，明日葉所含的膳食纖維也可為食品工業(yè)提供豐富的纖維功能成分來源[4]。隨著明日葉功能的不斷挖掘，明日葉被引進中國，并被推廣規(guī)?；N植。未曾關(guān)注的病害問題也日漸顯現(xiàn)，如由鏈格孢（Alternaria alternata）引起的葉斑病[5]，導(dǎo)致產(chǎn)量損失近40%，制約了明日葉產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。因此，明確該病病原菌的生物學特性及室內(nèi)藥劑的篩選，可為明日葉葉斑病的防治提供理論依據(jù)。目前關(guān)于明日葉的研究多在功能成分方面，有研究發(fā)現(xiàn)明日葉的抗血栓功能，對阿爾茨海默氏病引起的記憶缺陷的改善，明日葉提取物異煙肼酮的抑脂功能等[6-8]，對生產(chǎn)種植中病害的關(guān)注相對較少。研究表明，2017年湖北武漢地區(qū)發(fā)生明日葉葉斑病，經(jīng)鑒定其致病菌為鏈格孢（Alternaria alternata）[5]，而未見該致病菌生物學特性及室內(nèi)藥效等相關(guān)方面的報道，筆者以此為切入點開展研究，對導(dǎo)致明日葉葉斑病的鏈格孢進行生物學特性測定及室內(nèi)藥劑篩選，為進一步防控該病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

明日葉葉斑病病原菌鏈格孢（Alternaria alternata）（MG661807）由湖北省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所蔬菜栽培實驗室分離并保存，于2018年7月取出活化備用。11種化學藥劑于市場采購，詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 病原菌致死溫度的測定 試驗方法參考郭強等[9]的方法。取保存的病原菌接種于PDA培養(yǎng)基平板上進行活化，待菌落生長3 d后，用打孔器于菌落邊緣處打取直徑為9 mm的菌塊放置于1.5 mL離心管中，在不同溫度梯度下水浴10 min后接種于PDA平板，24 h后觀察菌絲生長情況。水浴溫度為30～65 ℃，每隔5 ℃為1個處理。每個處理3次重復(fù)。

1.2.2 不同pH對病原菌菌絲生長的影響 用HCl和NaOH分別將PDA的pH調(diào)至4、5、6、7、8、9、10和11共8個梯度后倒平板，用打孔器于菌落邊緣處打取直徑為9 mm的菌塊接于不同pH的PDA平板中央，25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，采用十字交叉法測量菌落直徑，測得數(shù)據(jù)平均值減去菌塊直徑9 mm，即為菌落生長直徑。每個處理3次重復(fù)。

1.2.3 氮源和碳源對病原菌菌絲生長的影響 以查氏（Czapek）培養(yǎng)基[10]為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以0.2 %的添加量分別添加甘氨酸、酵母、硫酸銨、硝酸鉀、蛋白胨、磷酸二氫銨、硝酸銨、L-谷氨酸鈉或硝酸鈉，配制不同氮源培養(yǎng)基，以無氮源培養(yǎng)基為對照;以3 %的添加量分別添加葡萄糖、D-果糖、α-乳糖、甘露醇、麥芽糖、可溶性淀粉或蔗糖，配制不同碳源培養(yǎng)基，以無碳源培養(yǎng)基為對照。用打孔器于菌落邊緣處打取直徑為9 mm的菌塊分別接于不同的培養(yǎng)基正中央，25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，采用十字交叉法測量菌落直徑，測得數(shù)據(jù)平均值減去菌塊直徑9 mm，即為菌落生長直徑。每個處理3次重復(fù)。

1.2.4 殺菌劑對病原菌的生長抑制作用的測定 利用菌絲生長速率法測定供試藥劑對病原菌的抑制效果[11]。試驗用的市售藥劑及使用濃度如表1所示。用無菌水配置藥劑母液，參照藥劑使用說明以一定的比例加入50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，使其達到推薦使用濃度，待充分混勻后倒入直徑為9 cm的玻璃培養(yǎng)皿中制成平板備用，以無菌水為對照。用打孔器于菌落邊緣處打取直徑為9 mm的菌塊分別接于不同的含藥培養(yǎng)基平板正中央，每個處理3次重復(fù)，25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，采用十字交叉法測量菌落直徑，并計算抑菌率，計算方法如下：

抑菌率/%=[（對照菌落直徑-初始接種菌餅直徑）-（處理菌落直徑-初始接種菌餅直徑] ×100/（對照菌落直徑-初始接種菌餅直徑）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)利用SPPS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，利用單因素方差分析比較差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌致死溫度的測定

將菌塊在不同溫度下水浴10 min后，觀察菌絲生長，當在溫度低于55 ℃時，24 h后均能長出菌絲;當溫度等于或高于55 ℃，24 h后菌絲不再生長。由此可見，明日葉葉斑病病原菌的致死溫度為55 ℃。

2.2 不同pH對菌絲生長的影響

病原菌在不同pH的PDA平板上培養(yǎng)3 d后的生長情況如圖1所示，病原菌在pH值為4～11時均能生長，隨著pH的升高病原菌的生長速度加快，當pH為8～10時，病原菌生長速度最佳，當pH繼續(xù)升高時，病原菌的生長變緩。

2.3 氮源和碳源對病原菌菌絲生長的影響

病原菌在含不同氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后的生長情況如圖2所示，病原菌對不同氮源的利用率存在顯著差異，由高到低分別為酵母浸出物>硝酸鈉>L-谷氨酸>硝酸鉀>蛋白胨>甘氨酸>硝酸銨>磷酸二氫銨>硫酸銨，對酵母浸出物的利用率最高，對硫酸銨和磷酸二氫銨的利用率最低，而對甘氨酸、硝酸鉀、蛋白胨、L-谷氨酸和硝酸鈉的利用率差異不明顯。由圖3可得，病原菌對不同碳源的利用也存在一定差異，由高到低分別為甘露醇>麥芽糖>α-乳糖>可溶性淀粉>蔗糖>D-果糖>葡萄糖，對葡萄糖利用最低，而對甘露醇、麥芽糖、α-乳糖和可溶性淀粉的利用率均相對較高。

2.4 殺菌劑對病原菌抑制作用測定

由表1可知，在含藥培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后測量統(tǒng)計可得，對該病原菌的菌絲生長抑制效果最佳的是稀釋1 000倍的60%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑和稀釋2 000倍的32.5%苯甲嘧菌酯懸浮劑，抑菌率均超過50%;稀釋600倍的30%噁霉靈水劑、稀釋500倍的30%苯甲·丙環(huán)唑乳油和稀釋1 000倍的38%甲霜福美雙可濕性粉劑對病原菌的抑菌率達40%左右;而其他藥劑在推薦使用濃度下對病原菌的抑制效果較差，其中稀釋500倍的50%多菌靈可濕性粉劑和木霉菌水分散粒劑的抑菌率最低，均未超過3%。

3 討論與結(jié)論

作為一種藥食兼用型蔬菜，明日葉在營養(yǎng)價值和保健功能上具有巨大的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景[2]。目前，對明日葉的研究主要在功能營養(yǎng)成分等方面，對其生產(chǎn)種植及病蟲害的關(guān)注相對較少，隨著明日葉的種植面積日益擴大，病蟲害的發(fā)生也開始顯現(xiàn)，筆者在前期對明日葉葉斑病病原菌鑒定的基礎(chǔ)上，對病原菌的生物學特性進行了測定，同時在室內(nèi)進行了藥劑篩選，為明日葉葉斑病的防治提供了理論依據(jù)。

鏈格孢是植物病害的一種重要致病菌，在多種植物上引起葉部病害，如中華獼猴桃褐斑病、非洲菊葉斑病、白菜黑斑病、牡丹黑斑病、紅橘褐斑病[12-16]等。本試驗中明日葉葉斑病由鏈格孢（Alternaria alternata）引起，對該病原菌的生物學特性測定發(fā)現(xiàn)，其致死溫度為55 ℃，最適pH范圍為8～10，最佳氮源為酵母浸出物，對甘露醇、麥芽糖、α-乳糖和可溶性淀粉等碳源的利用率均較高，與番茄黑斑病病原菌（Alternaria alternate）的適宜pH和最佳碳氮源相似[17];在室內(nèi)防治藥劑篩選試驗中，稀釋2 000倍的32.5%苯甲嘧菌酯懸浮劑和稀釋1 000倍的60%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑對該病菌的抑制效果最佳，抑菌率均超過50%，與木薯白點病致病菌鏈格孢的殺菌劑敏感性測定結(jié)果一致[18]。有研究表明，來源不同的鏈格孢病原菌對藥劑的敏感性存在明顯差異[14]，苯醚甲環(huán)唑?qū)σ鹄苯啡~斑病的鏈格孢屬病原菌的抑制作用相對較好，丙環(huán)唑和苯醚甲環(huán)唑?qū)σ鹩衩状蟀卟〉逆湼矜叩囊种菩Ч草^顯著，與本試驗的研究結(jié)果相似。由此可見，三唑類內(nèi)吸性殺菌劑對鏈格孢抑制效果相對穩(wěn)定;而異菌脲對核桃褐斑病和玉米大斑病的防治效果均十分顯著，但前人研究表明，鏈格孢易對異菌脲產(chǎn)生抗藥性，因此筆者并未對異菌脲進行防治效果進行測定[19-21]。

明日葉葉斑病致病菌適宜在高溫高濕、弱堿性和富含有機營養(yǎng)的條件下生長，而明日葉性喜涼，生長適宜溫度為12～22 ℃，因此在不影響明日葉正常生長的情況下，適當降低種植環(huán)境溫度可能對葉斑病的發(fā)生起到一定防控作用。田間防治藥劑可選擇苯醚甲環(huán)唑等三唑類殺菌劑，但由于環(huán)境因素的影響，田間的防治效果還有待進一步驗證。

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