發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)甜瓜轉(zhuǎn)基因過表達體系的建立

王平勇 徐永陽 趙光偉 賀玉花 李明 孔維虎 張健 劉水苗 劉夢麗 徐志紅

摘 要：遺傳轉(zhuǎn)化是實現(xiàn)基因功能驗證和基因快速轉(zhuǎn)育的重要手段，但目前甜瓜的遺傳轉(zhuǎn)化依舊存在眾多技術(shù)難題。筆者利用野生型發(fā)根農(nóng)桿菌K599侵染甜瓜‘E31，成功誘導(dǎo)甜瓜產(chǎn)生了不定根。借助該技術(shù)，將含有GUS基因和EGFP基因的過表達載體pCAMBIA3301和pCAMBIA1300-ProSuper導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599，利用轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌侵染甜瓜‘E31，成功誘導(dǎo)出了不定根。PCR檢測結(jié)果表明，新生不定根的陽性率達到100%。通過GUS染色和激光共聚焦顯微鏡檢測，在不定根中檢測到GUS基因和EGFP基因的大量表達，成功實現(xiàn)了外源基因在甜瓜新生不定根內(nèi)過表達。該方法周期短、操作方便、轉(zhuǎn)化率高，可實現(xiàn)基因功能的快速驗證，為甜瓜根系抗病抗逆方面的研究提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：甜瓜;發(fā)根農(nóng)桿菌;K599;過表達

Establishment of Agrobacterium rhizogenes-mediated gene overexpression system in melon

WANG Pingyong， XU Yongyang， ZHAO Guangwei， HE Yuhua， LI Ming， KONG Weihu， ZHANG Jian， LIU Shuimiao， LIU Mengli， XU Zhihong

（Zhengzhou Fruit Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450009， Henan， China）

Abstract： Genetic transformation is an important means to verify gene function and rapid gene transfer， but there are still many technical difficulties for melon . In this study， Agrobacterium rhizogenes K599 was used to infect melon ‘E31 and successfully induced the formation of adventitious roots. With this technique， the overexpression vectors pCAMBIA3301 and pCAMBIA1300-ProSuper containing GUS gene and EGFP gene， respectively， were introduced into A. rhizogenes K599. The modified A. tumefaciens K599 was used to infect melon ‘E31 and successfully induced the formation of adventitious roots. The results of PCR showed that the positive rate of new adventitious roots was 100%. The expression of GUS and EGFP genes in adventitious roots were successfully detected by GUS staining and confocal laser microscopy. This method has the advantages of short cycle， easy operation， high transformation rate， and can verify gene function in melon rapidly. It will provide technical support for the research on the mechanism of disease or stress resistance in melon root.

Key words： Melon; Agrobacterium rhizogenes; K599; Overexpression

甜瓜（Cucumis melo L.）在我國是一種重要的水果型蔬菜作物。我國自20世紀80年代以來，一直是世界上甜瓜種植面積和產(chǎn)量最大的國家[1]。甜瓜種質(zhì)資源多樣，具有豐富的遺傳多樣性，據(jù)考證至少有3 000份。我國于20世紀50年代開始開展甜瓜種質(zhì)資源的收集保存工作。目前，國家種質(zhì)資源西甜瓜中期庫（設(shè)于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所）保存的甜瓜種質(zhì)資源已達1 200余份[2]。隨著社會經(jīng)濟的飛速發(fā)展，消費者對瓜類產(chǎn)品的品質(zhì)要求也日益提高，品種更新?lián)Q代加快，給育種家?guī)砗艽髩毫?。通過常規(guī)方法選育品種周期長、效率低，已無法滿足當(dāng)前產(chǎn)業(yè)飛速發(fā)展的要求。目前，甜瓜基因組信息已經(jīng)公布，有關(guān)甜瓜的遺傳研究已進入后基因組時代[3]。雖然科學(xué)家借助基因組信息預(yù)測了大量與重要農(nóng)藝性狀相關(guān)的基因，但功能基因的驗證和轉(zhuǎn)育還面臨著眾多技術(shù)壁壘。遺傳轉(zhuǎn)化是實現(xiàn)基因功能驗證和基因快速轉(zhuǎn)育的重要手段，但目前甜瓜的遺傳轉(zhuǎn)化還存在品種依賴性強、再生體系建立困難、轉(zhuǎn)化率低、周期長等問題[4]。發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）屬于根瘤菌科（Rhizobitaceae）農(nóng)桿菌屬（A. grobacterium）的革蘭氏陰性菌，它的宿主范圍廣闊，侵染植物后能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生大量高度分支的不定根。這些不定根生長速度快，分化程度高、生理生化和遺傳性穩(wěn)定、易于進行操作控制[5]。目前，科學(xué)家利用發(fā)根農(nóng)桿菌在多種植物中成功誘導(dǎo)出了不定根，包括茄科、菊科、十字花科、旋花科、傘形科、豆科、石竹科、蓼科等草本植物，以及杏、葡萄等木本植物[6-8]。發(fā)根農(nóng)桿菌 K599是因20世紀70年代在英國等歐洲國家爆發(fā)的黃瓜毛根病而被發(fā)現(xiàn)的[9]。目前，利用K599在黃瓜、大豆等作物中已成功誘導(dǎo)產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因不定根。用轉(zhuǎn)基因不定根的方法研究基因功能不需要產(chǎn)生完整的轉(zhuǎn)基因植株，操作簡單快捷，近些年應(yīng)用的越來越廣泛[10-12]。筆者建立了一種K599快速誘導(dǎo)甜瓜產(chǎn)生不定根的方法，通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)，可實現(xiàn)外源基因在不定根中過表達，周期短，操作方便，轉(zhuǎn)化率高，可實現(xiàn)基因功能的快速驗證，為甜瓜根系抗病抗逆方面的研究提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為薄皮類型甜瓜‘E31，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所甜瓜育種課題提供。發(fā)根農(nóng)桿菌為A. rhizogenes K599，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所果樹生長調(diào)控課題組李明博士饋贈。pCAMBIA3301和pCAMBIA1300-ProSuper載體質(zhì)粒由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)楊文才教授課題組提供，分別攜帶GUS（β-glucuronidase）基因和EGFP（Enhanced Green Fluorescent Protein）基因。激光共聚焦顯微鏡型號為德國LEICA公司的TCS SP5。試驗于2018年9月至2019年7月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所進行。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)根農(nóng)桿菌K599感受態(tài)的制備 （1）吸取20 μL發(fā)根農(nóng)桿菌K599菌液，均勻涂布于含硫酸鏈霉素（Str）終質(zhì)量濃度為50 mg·L-1的LB固體培養(yǎng)基表面，28 ℃倒置培養(yǎng)48 h;（2）挑選單個農(nóng)桿菌菌落，接種到5 mL含硫酸鏈霉素（Str）終質(zhì)量濃度為50 mg·L-1 的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 220 r·min-1 震蕩過夜培養(yǎng);（3）吸取1 mL菌懸液接種于50 mL含有相同抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 220 r·min-1 震蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8;（4）將菌液冰浴30 min，之后轉(zhuǎn)移至50 mL滅菌離心管中，4 ℃ 5 000 r·min-1離心10 min，棄上清，收集菌體沉淀;（5）用100 mL 10%的滅菌甘油（冰上預(yù)冷）重懸菌體，4 ℃ 5 000 r·min-1離心15 min，棄上清;（6）重復(fù)步驟（5）3次;（7）再次用1 mL 10%的甘油懸浮菌體，分裝為每管50 μL，放入液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化 （1）電擊操作前，將電擊杯浸泡在75%的乙醇中數(shù)分鐘，之后取出在超凈工作臺晾干;（2）將農(nóng)桿菌感受態(tài)放置冰上，加入2 μL質(zhì)粒溶液，輕輕吸打混勻;（3）將混合液轉(zhuǎn)移至電擊杯中間，在2.2 kV電壓下電擊1 s;（4）將電擊杯迅速置于冰上，加入700 μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，吸打混勻后轉(zhuǎn)移至滅菌的2 mL離心管中，28 ℃ 220 r·min-1 震蕩3 h;（5）吸取100 μL培養(yǎng)后的菌液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基中（含Kan 50 mg·L-1，Str 50 mg·L-1），28 ℃倒置培養(yǎng)48 h;（6）待菌落長出后，挑選單個菌落置于LB液體培養(yǎng)基中（含Kan 50 mg·L-1，Str 50 mg·L-1），28 ℃ 220 r·min-1 震蕩過夜培養(yǎng);（7）選擇PCR檢測為陽性的菌液，按1∶50的比例接種LB液體培養(yǎng)基中（含Kan 50 mg·L-1，Str 50 mg·L-1），28 ℃ 220 r·min-1 震蕩過夜培養(yǎng)。吸取800 μL菌液至滅菌的2 mL離心管中，按1∶1的比例加入40%甘油，混勻后在液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 甜瓜不定根的轉(zhuǎn)化 （1）以薄皮類型甜瓜材料‘E31為試材，50 ℃溫湯浸種3 h，30 ℃催芽20 h，種子露白后播種于裝有營養(yǎng)土（V草炭∶V蛭石=2∶1）的口徑為7 cm的營養(yǎng)缽中，置于光照培養(yǎng)箱，光周期設(shè)置為12 h光照/12 h黑暗，晝夜溫度設(shè)為28/25 ℃。待幼苗子葉展平時接種農(nóng)桿菌;（2）用接種環(huán)挑取轉(zhuǎn)入目的載體的農(nóng)桿菌菌液，在LB固體培養(yǎng)基（含Kan 50 mg·L-1，Str 50 mg·L-1）表面劃線接種，置于培養(yǎng)箱中28 ℃倒置培養(yǎng)48 h。當(dāng)劃線處長出菌落且足夠用于接種時，準備接種;（3）用注射器挑取農(nóng)桿菌菌落從與下胚軸垂直的兩個方向刺穿幼苗的子葉節(jié)，侵染完用一次性塑料杯倒扣蓋在瓜苗上，置于培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)8～12 h，溫度設(shè)置為22 ℃，土壤濕度控制在80%以上;（4）黑暗培養(yǎng)后，將一次性塑料杯取下，剪掉杯底，將杯子正放套在幼苗上，向杯中填放蛭石，直至蛭石能掩蓋住幼苗接種部位，用塑料噴壺向蛭石噴水，直至蛭石濕透。處理后的幼苗放入光照培養(yǎng)箱，光周期設(shè)置為12 h光照/12 h黑暗，晝夜溫度設(shè)為28/25 ℃。每天補加蛭石，以保持接種部位的持續(xù)濕潤;（5）接種后20 d左右，可從接種部位長出不定根，將主根及下胚軸剪去（此時不定根可用于陽性檢測），將植株埋入營養(yǎng)土中（V草炭∶V蛭石=2∶1），注意保持土壤濕潤。

1.2.4 甜瓜不定根的檢測 （1）PCR檢測：從每條不定根上分別剪取少量根段提取DNA，根據(jù)載體序列設(shè)計引物，進行常規(guī)PCR反應(yīng)，有目的條帶的即為陽性根。pCAMBIA3301載體檢測引物為F：GACGTAAGGGATGACGCACAATC;R：TCATCATCATAGACACACGA。PCR反應(yīng)體系為：DNA模版1 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×PCR Master Mix 5 μL，dd H2O 3 μL。PCR反應(yīng)程序為95 ℃，3 min;95 ℃，30 s，50 ℃，30 s，72 ℃，50 s，35個循環(huán);72 ℃，10 min。pCAMBIA1300-ProSuper載體檢測引物為F：TCTTGATCCGCAGCCATTAACGACT;R：CACCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTG。PCR反應(yīng)體系同上，PCR反應(yīng)程序為 95 ℃，3 min;95 ℃，30 s，50 ℃，50 s，72 ℃，1 min，35個循環(huán);72 ℃，10 min。PCR 擴增結(jié)束后進行1%的凝膠電泳驗證;（2） GUS染色步驟：將甜瓜不定根浸泡在GUS染色液中，于37 ℃保溫過夜孵育; 過夜孵育后轉(zhuǎn)入70%乙醇中脫色2～3次，至陰性對照材料呈白色;肉眼或顯微鏡下觀察，白色背景上的藍色小點即為GUS基因的表達位點;（3）激光共聚焦顯微鏡檢測：取一小段不定根置于載玻片上，向根段滴少量蒸餾水，蓋上蓋玻片，確保蓋玻片能完全覆蓋根段并吸附在載玻片上，根段周圍不要有氣泡，借助激光共聚焦顯微鏡檢測EGFP基因在不定根內(nèi)的表達情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)根農(nóng)桿菌K599誘導(dǎo)甜瓜產(chǎn)生不定根

取未導(dǎo)入外源載體的野生型K599菌液，在LB固體培養(yǎng)基（Str 50 mg·L-1）表面劃線接種，置于培養(yǎng)箱中28 ℃倒置培養(yǎng)48 h后用于接種。接種后20 d左右，甜瓜‘E31子葉節(jié)處產(chǎn)生大量不定根（圖1）。說明利用上述方法，可成功誘導(dǎo)甜瓜產(chǎn)生不定根。

2.2 以pCAMBIA3301為載體通過發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)GUS基因的過表達

向野生型K599中導(dǎo)入含有外源GUS基因的載體pCAMBIA3301。待甜瓜‘E31的子葉節(jié)處長出不定根后，利用載體引物檢測不定根是否為陽性，目的條帶為293 bp。結(jié)果顯示，不定根的陽性率可達100%（圖2），新生不定根可被GUS染色液完全染成藍色（圖3-A～D）。

2.3 以pCAMBIA1300-ProSuper為載體通過發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)EGFP基因的過表達

向野生型K599中導(dǎo)入含有外源EGFP基因的載體pCAMBIA1300-ProSuper。待甜瓜‘E31的子葉節(jié)處長出不定根后，利用載體引物檢測不定根是否為陽性，目的條帶大小為800 bp。結(jié)果顯示，不定根的陽性率可達100%（圖4）。通過激光共聚焦顯微鏡觀察，可在新生不定根細胞中觀察到大量綠色熒光（圖5-A～D）。

3 討論與結(jié)論

本研究中幼苗的侵染時期選擇2片子葉剛剛展平，第1片真葉還未露頭的時期，此時植株的莖尖生長點還處于子葉節(jié)處，此處細胞分裂旺盛，選擇在子葉節(jié)處接種有利于農(nóng)桿菌的順利侵染[13]。由于濕度和光照對農(nóng)桿菌的侵染以及轉(zhuǎn)化細胞的組織分化有影響，因此需要在接菌后進行保濕和暗處理。本試驗中，接種后用一次性塑料杯倒扣蓋在瓜苗上，可增加接種部位周圍的空氣濕度。但甜瓜是喜光植物，光照不足會導(dǎo)致幼苗徒長，下胚軸嚴重伸長，不利于培養(yǎng)壯苗。此外，光照不足的情況下溫度太高也容易導(dǎo)致甜瓜幼苗的徒長。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)甜瓜幼苗在20 ℃以下會出現(xiàn)葉片向下卷曲的冷害癥狀，因此筆者將暗處理溫度設(shè)為22 ℃，可避免低溫寡照對幼苗的過多影響，保證農(nóng)桿菌的順利侵染以及轉(zhuǎn)化細胞的分化。暗處理8～12 h后，用蛭石將接種部位掩埋，可保證該部位處于黑暗條件。蛭石質(zhì)地疏松透氣，可避免接種部位腐爛，也便于后續(xù)對不定根進行采樣。在覆蓋蛭石的過程中需要注意的是，接菌后3～4 d，植株的第1片真葉還沒長出子葉節(jié)，應(yīng)避免此處被蛭石掩埋，以保證植株的生長。待真葉長出1 cm左右時，即可用蛭石將子葉及以下部分全部掩埋，保證接種部位完全黑暗，加速愈傷組織的形成和分化。

遺傳轉(zhuǎn)化是研究基因功能的重要手段。目前在葫蘆科作物中，黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化已較為成熟，而甜瓜的轉(zhuǎn)化依然存在較多問題，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率很低[14-16]。筆者建立了一種發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)甜瓜產(chǎn)生不定根的方法?；谠摲椒ǎㄟ^向發(fā)根農(nóng)桿菌K599中導(dǎo)入基因過表達載體pCAMBIA3301和pCAMBIA1300-ProSuper，成功實現(xiàn)了外源GUS基因和EGFP基因在新生不定根中的過表達，該方法周期短、操作方便、轉(zhuǎn)化率高，可實現(xiàn)基因功能的快速驗證，為甜瓜根系抗病抗逆方面的研究提供了技術(shù)支持。但是筆者僅驗證了外源基因在甜瓜新生不定根中的過表達體系，后續(xù)研究中將篩選合適的干擾表達載體以及基因編輯載體，探索基因干擾表達技術(shù)和基因編輯技術(shù)與發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)甜瓜產(chǎn)生不定根技術(shù)的結(jié)合運用。

發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植物產(chǎn)生的不定根具有數(shù)量多、生長迅速的特點，在藥用植物中利用毛狀根的培養(yǎng)可生產(chǎn)植物代謝產(chǎn)物，如利用青蒿毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)青蒿素、人參毛狀根生產(chǎn)人參皂苷、甘草毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)甘草酸、紅豆杉毛狀根生產(chǎn)紫杉醇、大豆毛狀根生產(chǎn)大豆異黃酮等[17-21]。葫蘆科作物中含有大量有益代謝產(chǎn)物，如葫蘆素、番茄紅素、瓜氨酸等，未來可利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)不定根的方法進行大量生產(chǎn)。

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