椎間盤退變血清與尿液分子標志物的研究進展

亓東鐸， 徐秀君 綜述， 黃宇峰 審校

(同濟大學附屬東方醫(yī)院脊柱?？?，上海 200120)

頸腰痛是患者就醫(yī)最常見的原因之一。在頸腰 痛患者中，大約39%是由椎間盤內紊亂引起的[1]。對于患者而言，頸腰痛給工作和生活帶來嚴重的負面影響[2]，同時醫(yī)保負擔也很沉重。據(jù)資料顯示： 頸腰痛的終身盛行率高達84%，有11%～ 12%的患者因頸腰痛而落下殘疾，并且頸腰痛給醫(yī)療行業(yè)帶來的影響如今日益加重，治療成本每年劇增，僅僅美國每年在頸腰痛上的醫(yī)療相關支出和患者報酬損失就超過2000億美元[3-4]。

目前，椎間盤退變造成的椎間盤突出等疾病的治療策略主要以減輕臨床癥狀為主，包括保守治療和外科手術。如果保守治療失敗,那么通常會選擇通過外科手術來減輕疼痛。脊柱融合術是治療椎間盤突出的金標準，但是其會造成臨近節(jié)段的退變，許多患者需要多次手術。近年來，通過促進細胞外基質的修復與再生來防止椎間盤退變的生物治療方法已經得到了發(fā)展，其中包括基因治療、基于干細胞的組織工程、調控椎間盤退變的生物因素以及microRNA的治療等方法。隨著研究的不斷突破，這些新的方法也許可以替代手術，用于椎間盤退變的早期干預，但是早期干預也對椎間盤退變的早期診斷提出了更高的要求。

目前，對于頸腰椎間盤突出的診斷還是根據(jù)病史、臨床體檢和影像學的一致性來判斷，而MRI被認為是最佳的非侵襲性影像學確診方法[2,5]。臨床上，MRI通過對椎間盤信號強弱及高度的不同來進行退變分級，但不能反映椎間盤退變的病程分期[6]，而且，影像學變化是滯后于組織病理學改變的，無法在病理變化的早期做出診斷。隨著椎間盤退變研究的深入，有學者發(fā)現(xiàn)，椎間盤退變患者血清或者尿液中細胞外基質降解產物和某些炎癥介質表達升高，并且其與椎間盤退變的病理變化同步或者早于其病理改變，相對于MRI，其可能成為椎間盤退變早期診斷的更合適的潛在分子標志物。同時，血液或者尿液分子標志物的檢測對腰椎間盤退變疾病的預防、預后和精確(分級、分期)診斷提供了可能。本文對椎間盤退變血清與尿液分子標志物的研究進展進行綜述，并探討分子標志物應用于臨床檢測的可能性。

1 細胞外基質降解產物

椎間盤主要由終板軟骨、髓核、纖維環(huán)三部分構成。脊柱作為人體質量要的承重結構之一，椎間盤在維持人體力學傳遞與人體脊柱活動中發(fā)揮著重要作用。其中，椎間盤的細胞外基質在維持椎間盤軟骨結構光滑和緩沖作用力等方面具有重要意義。椎間盤的細胞外基質主要由蛋白聚糖、Ⅱ型膠原和Ⅰ型 膠原構成。蛋白聚糖是椎間盤細胞外基質中最主要的成分之一。蛋白聚糖是一個帶負電的大分子。它具有強烈的親水性，能夠維持椎間盤軟骨中較高的含水量；同時蛋白聚糖能與許多椎間盤相關的生長因子結合，在維持椎間盤的生長與信號傳遞等方面具有重要作用。Ⅱ型膠原是椎間盤細胞外基質構成中最主要的膠原，占椎間盤干重的50%～ 60%。它是一種具有強大的抗壓能力的膠原，主要位于髓核和軟骨終板組織中，在維持椎間盤細胞外基質的機械穩(wěn)定性，傳遞機械力，維持椎間盤的力學穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。Ⅰ型膠原主要位于纖維環(huán)組織，具有防止髓核組織突出、維持纖維環(huán)結構完整的重要作用。

1.1 血清及尿Ⅱ型膠原羧基末端肽(C-telopeptide of type Ⅱ collage, CTX-Ⅱ)

Ⅱ型膠原是椎間盤細胞外基質中主要的大分子物質[7]。Ⅱ型膠原是由3條相同的多肽鏈-α鏈構成的三螺旋蛋白。α鏈最初的形式是α鏈前體，由氨基末端和羧基末端的前肽、位于中間的三螺旋結構及前肽和三螺旋結構之間的端肽三部分組成[8]。在修飾的過程中，兩端的前肽被酶水解，只留下三螺旋結構和端肽，成為膠原前體，膠原前體之間再通過交聯(lián)結構連接形成膠原纖維網狀結構。

Ⅱ型膠原在維持椎間盤的結構穩(wěn)定和功能完整中發(fā)揮著重要作用[8]。椎間盤退變的主要病理表現(xiàn)為髓核和纖維環(huán)中的Ⅱ型膠原降解和被Ⅰ型膠原逐漸取代[9-10]。椎間盤退變過程中，Ⅱ型膠原的降解與變化是由各種金屬基質蛋白酶(matrix metallo-proteinase, MMPs)，如MMP1、MMP3、MMP13等所主導的[11]。Ⅱ型膠原在金屬基質蛋白酶的作用下首先被水解成為形成了一個具有794個氨基酸大小的Ⅱ型3/4片段和具有266個氨基酸大小的Ⅱ型1/4片段。接下來這兩種片段的三螺旋結構解螺旋，并進一步由其他蛋白水解酶降解。Ⅱ型膠原的終產物主要包括： CTX-Ⅱ、Ⅱ型膠原新抗原表位(TIINE)和硝化的Ⅱ型膠原-1(Coll2-1NO2)。其中CTX-Ⅱ是椎間盤內Ⅱ型膠原被MMPs降解的主要產物之一，為Ⅱ型膠原1/4片段的羧基端端肽的降解產物[12]。因此隨著椎間盤退變的發(fā)生，外界的血管不斷侵入，血清CTX-Ⅱ等物質則可以進入血液，這為血液或者尿液分子標記診斷椎間盤退變性疾病提供了理論基礎。

目前，研究發(fā)現(xiàn)，血清與尿CTX-Ⅱ是骨性關節(jié)炎與類風濕性關節(jié)炎的潛在分子標志物。有研究顯示，血清CTX-Ⅱ在類風濕性關節(jié)炎中顯著增高，并且與MMP3呈正相關，表明血清CTX-Ⅱ可以作為類風濕性關節(jié)炎嚴重程度和預后判斷的重要指標[13-15]。有研究表明，血清或者尿CTX-Ⅱ水平與骨性關節(jié)炎表面軟骨破壞程度、K-L評分和關節(jié)間隙狹窄程度呈正相關，推測CTX-Ⅱ是骨性關節(jié)炎重要的預后判斷的分子標志物[16]。另有研究發(fā)現(xiàn)，隨著骨性關節(jié)炎與類風濕性關節(jié)炎病情的控制，血清和尿CTX-Ⅱ濃度逐漸降低，推測其可以作為判斷骨性關節(jié)炎[17]與類風濕性關節(jié)炎[15]治療效果的潛在標志物。

關于椎間盤退變中血清與尿液CTX-Ⅱ水平同樣已有研究。Garnero等[18]檢測了324名絕經后婦女的尿液，發(fā)現(xiàn)尿液CTX-Ⅱ水平與脊柱的椎間隙狹窄及伴有臨床癥狀的膝關節(jié)骨性關節(jié)炎、手骨性關節(jié)炎均密切相關。近年來，Brayda-bruno等[19]比較了79例椎間盤正常與椎間盤退變的男性患者的血清維生素D、CTX-Ⅰ和CTX-Ⅱ水平，發(fā)現(xiàn)血清活性維生素D和血清CTX-Ⅱ水平在1年內呈顯著的節(jié)律分布，血清活性維生素D與血清CTX-Ⅰ呈正相關，血清CTX-Ⅰ與CTX-Ⅱ水平呈負相關；且伴有骨軟骨病的椎間盤退變患者血清CTX-Ⅱ水平比正常人顯著升高。Meulenbelt等[20]通過分析302名患者的尿液CTX-Ⅱ水平，發(fā)現(xiàn)尿液CTX-Ⅱ水平與膝關節(jié)、髖關節(jié)骨性關節(jié)炎和椎間盤退變密切相關。

以上研究表明，血液和尿液的CTX-Ⅱ水平是椎間盤退變潛在的分子標志物。在椎間盤退變過程中，細胞外基質降解是其重要的病理變化之一。Ⅱ型 膠原是椎間盤細胞外基質構成最主要的膠原之一。CTX-Ⅱ具有緊密交聯(lián)的肽端結構區(qū)域，其在血液中存在較為穩(wěn)定,當退變發(fā)生時其降解產物釋放入血，因此，血液中CTX-Ⅱ含量與椎間盤退變和細胞外基質破壞密切相關；且CTX-Ⅱ由于相對分子質量較小,容易經腎臟濾過,使其在尿液中亦較為穩(wěn)定。因此，通過檢測患者的血液或者尿液中CTX-Ⅱ水平，可以為椎間盤退變的預防、嚴重程度判斷和疾病預后預測帶來幫助。

1.2 血清COMP與椎間盤退變

寡聚基質蛋白(cartilage oligomeric matrix protein, COMP)是近年來新發(fā)現(xiàn)的血小板鈣黏附蛋白家族的重要成員，具有5個獨立的次級單位，是由二硫鍵相連的五聚蛋白，相對分子質量為524000。1992年，瑞典LUND大學Dick Heinegard教授首先在軟骨組織中發(fā)現(xiàn)并報道了COMP。COMP能與Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Ⅸ型膠原、纖維肌絲蛋白和蛋白聚糖結合，在軟骨細胞外基質的構成、穩(wěn)定及傳遞親水分子中發(fā)揮重要作用。COMP最開始于關節(jié)軟骨中被發(fā)現(xiàn)，隨著研究的深入，研究發(fā)現(xiàn)其在肌腱，韌帶、關節(jié)滑膜中也有不同程度的表達。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)，COMP與關節(jié)軟骨破環(huán)、細胞外基質降解密切相關。隨著研究的深入，部分學者認為其不僅可以因為與軟骨破壞及基質降解相關而有望成為膝關節(jié)、髖關節(jié)與類風濕性關節(jié)炎的骨性標志物，還可以作為膝關節(jié)與髖關節(jié)骨性關節(jié)炎預后判斷與治療效果判斷的重要的分子標志物。在椎間盤的細胞外基質中，COMP通常與Ⅱ型膠原和蛋白聚糖相結合，在軟骨組織膠原網中起穩(wěn)定的作用，并有助于椎間盤的完整性[21]。就其本質來說，與CTX-Ⅱ類似，COMP是一類在軟骨基質破壞、降解過程中釋放到血液中的大分子物質。

Goode等[22]通過分析547名患者的血清COMP、透明質酸、尿液CTX-Ⅱ水平，發(fā)現(xiàn)血清透明質酸與女性椎間隙狹窄密切相關；同時尿液CTX-Ⅱ與椎間隙狹窄相關，血清COMP與由椎間隙狹窄患者引起的腰背痛密切相關。

椎間盤退變與骨性關節(jié)炎和類風濕性關節(jié)炎類似，是一種以細胞外基質降解為主要特點的軟骨退變性疾病[23]。因此，CTX-Ⅱ與COMP作為細胞外基質降解后釋放到血液的分子，是椎間盤退變潛在的分子生物標志物。目前CTX-Ⅱ與COMP在骨性關節(jié)炎和類風濕性關節(jié)炎研究較深入[24]，CTX-Ⅱ與COMP相關性及作為椎間盤退變分子標志物研究較少。其作為椎間盤退變的臨床標志物的可靠性需要進一步的動物與臨床實驗加以研究與證實。

2 血清炎癥介質

炎癥分子在椎間盤的退變過程中發(fā)揮著很大作用。在椎間盤退變過程中，伴隨著白介素、TNF-a、MMPs等炎癥因子的產生。在椎間盤退變患者血清中，某些炎癥因子表達顯著升高。

Xie等[25]利用蛋白芯片技術分析了30例正常人與30例椎間盤突出患者的血清，發(fā)現(xiàn)載脂蛋白L1(apolipoprotein L1, Apo L1)和兩種血清白蛋白前體在伴有坐骨神經痛的椎間盤突出患者中高表達，載脂蛋白M(apolipoprotein M, Apo M)、四聯(lián)凝素(tetranectin, TN)和免疫球蛋白輕鏈(immunoglobu-lin light chain, IGL)在伴有坐骨神經痛的椎間盤突出患者中低表達；進一步通過ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)其中4個指標(Apo L1、Apo M、TN、IGL)差異具有統(tǒng)計學意義，認為Apo L1、Apo M、TN、IGL可作為椎間盤退變診斷的分子標志物。Apo L1是特異表達在正常主動脈和大血管內皮細胞中的蛋白，它的表達量常常反映TNF水平和人體炎癥狀態(tài)。Apo M和Apo L1是與炎癥相關的蛋白[26-27]。載脂蛋白L(Apo L)是一種屬于脂質運載蛋白家族的血漿蛋白質。在動脈硬化過程中，內皮細胞在長期慢性炎癥的刺激下，分泌大量TNF-α，從而上調Apo L1的表達。TNF-a在腰椎間盤退變引起的炎癥反應中起重要作用。TN是骨骼、肌肉細胞外基質中的重要成分，常在外傷、心肌梗死、惡性腫瘤、類風濕性關節(jié)炎時表達降低[28]。

2016年，Ye等[29]通過比較40例患者血清IL-8水平，發(fā)現(xiàn)椎間盤退變患者IL-8比正常人高，其表達量與椎間盤退變的分級呈正相關；并且發(fā)現(xiàn)IL-8能上調MMP3的表達，下調Collagen2和Aggrecan的表達。Weber等[30]通過檢測107例患者血清，發(fā)現(xiàn)IL-6、MMP-1在伴有椎間盤退變的慢性腰背痛患者血清中表達增高，且MMP-1在慢性腰背痛患者中升高較為明顯。血清IL-6水平與椎間盤退變的關系在Deng等[31]的研究中進一步得到證實。2010年，Kraychete等[32]通過比較23個正常人與10個椎間盤退變患者的血清，發(fā)現(xiàn)IL-1和TNF-a在椎間盤退變患者中表達顯著增高。IL-1和TNF-a是在椎間盤退變中起主要作用的炎癥介質，同時，研究發(fā)現(xiàn)血清TNF-a受體與椎間盤退變密切相關[33]。

趨化因子5(CCL5)、趨化因子6(CXCL6)是椎間盤退變過程中重要的炎癥介質。近年來，Grad等[34]比較了40個正常人與40個椎間盤退變患者的血清，發(fā)現(xiàn)CCL5在退變椎間盤患者血清中表達量是正常人1.5倍，CXCL6是正常人1.3倍。

椎間盤退變過程中伴隨著大量炎癥因子的產生，炎癥因子的產生同時又可以進一步加劇椎間盤退變的進程。有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子的量與椎間盤退變程度呈一定正相關。以上研究表明，椎間盤退變患者血液中的炎癥介質的量或許是評價椎間盤退變程度的潛在分子標志物。

對血液與尿液分子標志物的檢測雖然是一種可靠的方法，但是椎間盤退變性疾病和骨性關節(jié)炎等軟骨退變性疾病類似，本質上也屬于細胞外基質降解和炎癥反應的軟骨退變性疾病。因此上述分子標志物對椎間盤退變的疾病的診斷或許特異性不高，這需要后續(xù)研究對骨性關炎等與椎間盤在解剖與生理上加以驗證與區(qū)分。隨著對椎間盤解剖與生理的研究不斷深入，或許椎間盤組織更加特異性的物質將被發(fā)現(xiàn)，這將為椎間盤的血液與尿液診斷提供新的可能。

3 展 望

目前，MRI是臨床上診斷椎間盤退變的金標準，但其具有滯后于病理改變的特點——當MRI檢測出退變時，患者椎間盤的破壞往往已不可逆。因此，對椎間盤退變的早期診斷可以為椎間盤退變篩查、預防及干細胞等生物治療提供重要基礎。確定血清COMP及血清和尿CTX-Ⅱ等分子標志物是否為椎間盤突出生物標志物，將為椎間盤退變性疾病的診斷和治療提供很好的理論依據(jù)和實用基礎，還可以為椎間盤退變性疾病患者提供早期篩查工具。若后續(xù)研究證明血清COMP及血清、尿CTX-Ⅱ等分子標志物不是椎間盤退變早期相關的生物學指標，相關成果也可以為后續(xù)研究提供指導。隨著基因芯片表達譜的研究的深入，部分microRNA[35]、LncRNA、Runx2 mRNA[36]被認為與椎間盤退變密切相關，在血液或者尿液中檢測其表達情況，發(fā)現(xiàn)差異表達的相關分子將是研究椎間盤退變潛在的分子標志物又一重要方向。