奶山羊遺傳育種與繁育技術(shù)研究進(jìn)展

文/文 靜

（慶陽偉赫乳制品有限公司）

奶山羊適應(yīng)性強(qiáng)，分布廣，日采食量低，具有單位體重產(chǎn)奶多、飼料范圍廣、抗病能力強(qiáng)等特性，非常適合中國人口眾多、糧食不足的基本國情[1]。我國是世界上飼養(yǎng)奶山羊數(shù)最多的國家之一，具有快速發(fā)展奶山羊的數(shù)量優(yōu)勢。根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，截至2012年，世界范圍內(nèi)羊（包括山羊和綿羊）的存欄量為37 218.6 萬只，其中我國存欄7 146.0 萬只，占世界存欄量的19.2%，2013年我國奶山羊存欄為1 300 多萬只[1，2]。

現(xiàn)代研究證明，羊奶中含有200 多種營養(yǎng)素和生物活性物質(zhì)，其中球蛋白含量高于牛奶，而酪蛋白含量遠(yuǎn)低于牛奶，接近于人奶，更易于人的消化吸收。羊奶中的脂肪球大小僅為牛奶的1/3，同時羊奶中表皮細(xì)胞生長因子（Epidermal Growth Factor，EGF）能有效緩解皮膚衰老，所以羊奶被稱為“奶中之王”[3]。在羊奶生產(chǎn)中，決定家畜轉(zhuǎn)化率的主要因素是良種，如果沒有產(chǎn)奶量高、乳品質(zhì)好的奶山羊品種，就達(dá)不到優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的目標(biāo)，不符合現(xiàn)代畜牧業(yè)的需求。因此，如何在做好引進(jìn)優(yōu)良品種的同時，充分利用雜交優(yōu)勢與遺傳育種新技術(shù)，加快培育奶山羊新品種，是奶山羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

1 奶山羊遺傳育種進(jìn)展

隨著分子生物技術(shù)，如基因編輯技術(shù)的改進(jìn)，基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等新興學(xué)科飛速發(fā)展。家畜動物育種計(jì)劃和家畜動物分子遺傳學(xué)研究取得大量突破性成果，家畜動物育種已經(jīng)從傳統(tǒng)的育種方法向快速改善動物基因型的分子水平方向發(fā)展，分子育種技術(shù)已漸漸成為奶山羊育種的新方向。

1．1 奶山羊的傳統(tǒng)育種方法

傳統(tǒng)育種方法是以遺傳學(xué)的基本理論為基礎(chǔ)、以表型選擇為主的育種措施。根據(jù)表型值推斷基因型或計(jì)算育種值，進(jìn)而做出性能的總體評估。傳統(tǒng)的奶山羊育種方法是將數(shù)量遺傳學(xué)原理應(yīng)用于育種實(shí)踐，通過采用雜交改良、品系選育等技術(shù)，實(shí)現(xiàn)奶山羊品種不斷改良和雜種優(yōu)勢利用的方法。數(shù)量遺傳學(xué)是指運(yùn)用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法和適宜的遺傳模型分析數(shù)量性狀遺傳規(guī)律的理論科學(xué)，是遺傳學(xué)的重要分支。

最佳線性無偏預(yù)測法（Best linear unbiased prediction，BLUP）是1949年Henderson 提出的。BLUP法主要廣泛應(yīng)用于種公畜的評定，而且用于估計(jì)遺傳趨勢和配合力等。BLUP法的基本原理是線性統(tǒng)計(jì)模型方法論與數(shù)量遺傳學(xué)相結(jié)合，其模型包括固定效應(yīng)和除殘差效應(yīng)外的隨機(jī)效應(yīng)。雒鳴峰和劉蔭武教授應(yīng)用BLUP法估計(jì)西農(nóng)薩能奶山羊的育種值和遺傳趨勢，分析了過去的育種效果，為確定西農(nóng)薩能奶山羊的育種目標(biāo)，建立系統(tǒng)的選種體系，提供了基本參數(shù)和依據(jù)。研究結(jié)果顯示，西農(nóng)薩能奶山羊在1960—1985年間初產(chǎn)母羊300 天產(chǎn)奶量的遺傳趨勢為7.2 kg，表明西農(nóng)薩能羊群的選育卓有成效[4]。

約束最大似然（Restricted maximum likelihood method，REML）法將校正固定效應(yīng)后與隨機(jī)效應(yīng)有關(guān)的多元正態(tài)似然函數(shù)極大化，對觀測值y的線性函數(shù)求導(dǎo)，約束K，x=0，求滿足似然函數(shù)最大化的方差組分。REML法求得的方差組分估值不受先驗(yàn)值的影響，通過迭代可得到唯一解，其估計(jì)值不會越出參數(shù)空間。當(dāng)樣本含量較大時，REML法可得到近似無偏估值，對于均衡資料REML法可得到無偏估值。雒鳴峰和常智杰教授應(yīng)用REML估測幾項(xiàng)奶山羊產(chǎn)奶性狀的遺傳力、遺傳相關(guān)和表型相關(guān)系數(shù)，得出西農(nóng)莎能奶山羊第一胎母羊的最高日產(chǎn)奶量、90天產(chǎn)奶量和300天產(chǎn)奶量的遺傳力分別為0.1397、0.2403和0.3746，三性狀間存在很高的正向遺傳和表型相關(guān)。忽略公羊間相關(guān)性會導(dǎo)致遺傳方差的偏低估計(jì)[5]。在生產(chǎn)實(shí)踐中，對于一個有限的育種群體，公羊間必然存在一定程度的相關(guān)性，因此估計(jì)遺傳參數(shù)時應(yīng)用A-1模型。

1．2 奶山羊現(xiàn)代育種方法

隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入以及新的生物技術(shù)的出現(xiàn)，奶山羊現(xiàn)代育種工作可以采用的新技術(shù)有很多，如原核期胚胎顯微注射技術(shù)、體細(xì)胞核移植技術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體技術(shù)、胚胎干細(xì)胞技術(shù)、SNP篩選技術(shù)、基因定點(diǎn)整合技術(shù)等。這些現(xiàn)代育種技術(shù)大大地縮短了育種時間，同時使育種方向更加明確。

1．2．1 顯微注射技術(shù)

顯微注射技術(shù)（Microinjection）由美國人G o r d o n發(fā)明，后經(jīng)Brinster等人改進(jìn)，一直沿用至今[6]。其原理是通過顯微操作儀將外源基因直接用注射器注入受精卵的原核內(nèi)，在DNA的復(fù)制過程中使外源基因整合到動物基因中，再通過胚胎移植到受體子宮內(nèi)繼續(xù)發(fā)育，獲得具有新基因的奶山羊。

1．2．2 體細(xì)胞核移植技術(shù)

體細(xì)胞核移植技術(shù)（Somatic Cell Nuclear Transfer）也就是體細(xì)胞克隆技術(shù)，是將成年羊的體細(xì)胞移植到去核的卵母細(xì)胞中，然后發(fā)育成新個體。1996年多莉羊的出生宣告該技術(shù)的成功[7]，2000年西北農(nóng)林科技大學(xué)張涌教授克隆出第一只山羊[8]。隨著技術(shù)進(jìn)步通過體細(xì)胞克隆技術(shù)，可以將優(yōu)良性狀的奶山羊進(jìn)行擴(kuò)繁。

1．2．3 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體技術(shù)

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體技術(shù)用攜帶外援基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染胚胎，從而導(dǎo)入外源基因。其基本原理是利用逆轉(zhuǎn)錄的長末端重復(fù)（longterminalrepeat，LTR）區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄啟動子活性這一特點(diǎn)，將外源基因連接到LTR下游進(jìn)行重組，再使其包裝成為高滴度病毒顆粒，去直接感染受精卵或微注射入囊胚腔[9]。攜帶外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)入細(xì)胞后，RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，依靠逆轉(zhuǎn)錄病毒的整合酶及其末端特異的核苷酸序列，DNA可以整合到染色體上，從而將其所攜帶的外源基因插入到染色體中。雷蕾等（2013）研究顯示，采用山羊胎兒成纖維細(xì)胞為供體細(xì)胞，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶四個轉(zhuǎn)錄因子，對山羊體細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)重編程，并且將誘導(dǎo)重編程細(xì)胞定向轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞和卵母樣細(xì)胞[10]。

1．2．4 胚胎干細(xì)胞

胚胎干細(xì)胞（Embryonic Sterm Cell，ES）的研究萌芽于畸胎瘤干細(xì)胞，或者成為胚胎癌細(xì)胞（Embryonic Carcinoma Cell）。Steven最早發(fā)現(xiàn)ES細(xì)胞，她把小鼠早期胚胎移植到129只精囊或腎的被膜下[11]，得到了該細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞是從哺乳動物囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（Inner Cell Mass，ICM）和原始生殖細(xì)胞（Primordial Germ Cell，PGCS）經(jīng)體外分化、抑制培養(yǎng)并分離克隆出來的一種原始、高度未分化的細(xì)胞，具有自我復(fù)制、更新和發(fā)育全能性并產(chǎn)生后代能力的早期胚胎細(xì)胞[12]。胚胎干細(xì)胞在特定條件下可分化為200 多種細(xì)胞類型，并可構(gòu)建心、肝、腎等各種組織和器官，最后能發(fā)育成一個完整的個體，但目前沒有應(yīng)用在奶山羊上的研究。

1．2．5 單核苷酸多態(tài)性

單核苷酸多態(tài)性（S i n g l e Uucleotide Polymorphisms，SNPs）是個體間由完全相同序列界定的單個核苷酸的差異，單堿基轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失，與其他分子相比，SNPs分辨率最高也最為豐富，覆蓋基因組范圍大，遺傳性能比較穩(wěn)定[13]。SNPs作為DNA研究工具，用于遺傳圖譜構(gòu)建、品種改良、關(guān)聯(lián)分析等很多領(lǐng)域。陳志等進(jìn)行了山羊生長激素釋放激素受體（Growth Hormone-Releasing Hormone Receptor，GHRH-R）基因SNPs的快速篩查，對基因頻率進(jìn)行了估算[14]。吳賢峰等進(jìn)行了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化蛋白3（Signal Transducers and Activators of Transcription 3，STAT3）和STAT5A基因SNPs研究[15]。嚴(yán)妍對奶山羊促性腺激素抑制激素（Gonadotropin-Inhibitory Hormone，GnIH）基因SNPs研究，并和產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析[16]。

1．2．6 基因定點(diǎn)整合技術(shù)

基因定點(diǎn)整合技術(shù)是一種能夠精確靶向修飾生物基因組，實(shí)現(xiàn)對基因定點(diǎn)敲除和外源基因定點(diǎn)整合的技術(shù)。新出現(xiàn)的有鋅指核酸酶（Zinc-Finger Uuclease，ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Uucleases，TALEN）和規(guī)律性重復(fù)短回文序列簇與Cas9蛋白（CRISPRs/Cas9）系統(tǒng)[17]。3 種新型的基因組編輯技術(shù)通過特異性結(jié)構(gòu)識別靶位點(diǎn)，核酸酶發(fā)揮切割作用對靶位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)編輯。Malpotra等（2017）通過CRISPRs/Cas9敲除了山羊原代培養(yǎng)細(xì)胞的rig-i基因[18]。周文軍等（2017）通過CRISPRs/Cas9系統(tǒng)敲出了β-乳球蛋白基因[19]。關(guān)于基因定點(diǎn)整合技術(shù)在現(xiàn)代育種研究中處于實(shí)驗(yàn)室階段，期待未來對奶山羊育種發(fā)揮切實(shí)的推進(jìn)作用。

2 奶山羊繁育技術(shù)進(jìn)展

人工授精、胚胎移植、同期發(fā)情等技術(shù)的應(yīng)用對20世紀(jì)奶山羊的改良產(chǎn)生了巨大的影響。隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，奶山羊繁育中以胚胎工程、基因工程為主體的高新技術(shù)將成為奶山羊繁育的主要方向，胚胎移植、體外胚胎生產(chǎn)會越來越成熟，將被更多的奶山羊生產(chǎn)實(shí)踐繁育工作所采納。

人工授精是指采用非自然交配的方式將精子遞送到母羊生殖道中使奶山羊懷孕的一種輔助生殖技術(shù)，一般包括采精、精液檢驗(yàn)、精液稀釋、輸精等步驟。人工授精技術(shù)提高了優(yōu)良種公羊的配種效能和種用價(jià)值，加速奶山羊品種改良，促進(jìn)育種工作。在生產(chǎn)實(shí)踐中，20 只母羊配備1只種公羊，而采用人工授精技術(shù)，200 只母羊配備1 只種公羊，減少了種公羊的飼喂成本，降低了飼養(yǎng)管理費(fèi)用。同時可有效防止各種疾病的發(fā)生，尤其是生殖道傳染性疾病。目前人工授精技術(shù)已經(jīng)被許多奶山羊養(yǎng)殖場所推廣應(yīng)用。

胚胎移植技術(shù)自20世紀(jì)30年代進(jìn)入畜牧科學(xué)領(lǐng)域以來，首先在綿羊上獲得成功，到40年代末和50年代初相繼在山羊、豬、牛、馬上取得成功。我國胚胎移植技術(shù)的研究從1973年開始，1974年在綿羊上獲得成功。1980年王建辰等在西北農(nóng)學(xué)院進(jìn)行了奶山羊胚胎移植試驗(yàn)，并取得了成功[20]。隨著同期技術(shù)及胚胎移植技術(shù)的提升，西北農(nóng)林科技大學(xué)羅軍教授團(tuán)隊(duì)于2010年試驗(yàn)中選用8 只供體羊，28 只受體羊，共收集116 只胚胎，其中選用86 只質(zhì)量較好的胚胎進(jìn)行移植，共產(chǎn)出37 只羔羊[21]。目前在生產(chǎn)實(shí)踐中，已經(jīng)有一些養(yǎng)殖場引入了胚胎移植技術(shù)，為養(yǎng)殖場改良生產(chǎn)群，提高良種數(shù)量提供了好的方法。在實(shí)踐過程中，受同期處理、胚胎移植手術(shù)水平、奶山羊子宮容受性、飼養(yǎng)管理等多方面因素影響，奶山羊胚胎移植成功率還不是很高，同時花費(fèi)相對較高。因此胚胎移植技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室走向生產(chǎn)實(shí)踐，還有待進(jìn)一步提升。

性別控制技術(shù)是通過人工干預(yù)控制奶山羊后代性別比例的方法。奶山羊養(yǎng)殖場需要更多的母羊用于產(chǎn)奶，所以提高母羔的比例對于養(yǎng)殖場快速擴(kuò)繁有重要的積極意義。目前主要使用流式細(xì)胞儀對精子進(jìn)行分離，前期試驗(yàn)表明，奶山羊X染色體和Y染色體差異大于奶牛，在4%左右，更有利于進(jìn)行分離。雖然有企業(yè)已經(jīng)生產(chǎn)出奶山羊性控凍精，但是目前主要采用子宮角輸精，技術(shù)難度較大，在生產(chǎn)實(shí)踐中推廣存在一定難度。

3 前景展望

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展，繁育技術(shù)研究的不斷深入和產(chǎn)業(yè)化，奶山羊育種從傳統(tǒng)以數(shù)量性狀為主的育種方法向著快速改變基因型方向發(fā)展。奶山羊新的育種技術(shù)和一系列改進(jìn)的高新繁育技術(shù)的結(jié)合與應(yīng)用，必將對奶山羊繁殖育種工作產(chǎn)生革命性影響，改良奶山羊生產(chǎn)和發(fā)展模式是今后發(fā)展高效、優(yōu)質(zhì)羊奶事業(yè)的必然趨勢和方向。