分散液-液微萃取結(jié)合磁固相萃取用于增香保潤(rùn)劑樣品中抗氧化劑的測(cè)定

劉春波， 楊光宇， 劉志華， 申欽鵬， 張鳳梅， 何 沛， 蔣 薇， 唐石云， 尤俊衡， 趙 嬌， 楊亞玲*

(1.云南省煙草化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南昆明 650231；2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650500)

增香保潤(rùn)劑是由多種香料、丙二醇及適量溶劑以及其他成分調(diào)配而成，但在生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)添加一些合成酚類(lèi)的抗氧化劑，用來(lái)延緩其氧化速度。我國(guó)常用的合成酚類(lèi)抗氧化劑(SPAs)有叔丁基羥基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)、沒(méi)食子酸丙酯(PG)、叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)等，但它們均有一定的毒性[1 - 3]。目前，對(duì)于SPAs的檢測(cè)主要有電化學(xué)分析法[4]、高效液相色譜法[5]、氣-質(zhì)聯(lián)用法[6]和液-質(zhì)聯(lián)用法[7]等。而用于抗氧化劑測(cè)定的前處理方法主要有固相萃取(SPE)[8]、雙水相萃取(ATPE)[9]、液-液微萃取(LLME)[10]、中空纖維膜液相微萃取(HF-LPME)[11]等。分散液-液微萃取(DLLME)是由Assadi等于2006年首次提出的一種新型的樣品前處理技術(shù)[12]。然而,經(jīng)典的DLLME也有一些缺點(diǎn)，這些缺點(diǎn)在一定程度限制了該技術(shù)的應(yīng)用。磁固相萃取(MSPE)[13]是近年發(fā)展起來(lái)的又一種新型樣品前處理技術(shù)，它選用有磁性的或者可以磁化的材料作為吸附劑,直接將磁性吸附劑分散在樣品溶液中,通過(guò)施加一個(gè)外部磁場(chǎng)便可以使吸附劑與樣品溶液分離。此外,磁性吸附劑能完全的分散在樣品溶液中，可提高萃取效率。

本文選用正癸酸(DA)對(duì)Fe3O4顆粒進(jìn)行包覆，得到表面包覆正癸酸的磁性納米顆粒(DA@Fe3O4MNPs)。辛醇通過(guò)渦旋作用力以微滴形式均勻分散在溶液中形成乳濁液，使目標(biāo)分析物快速萃取到辛醇中。通過(guò)DA@Fe3O4MNPs表面的親酯基團(tuán)與脂肪醇(正辛醇)之間形成疏水作用力，將辛醇液滴吸附在磁性納米粒子表面，再通過(guò)外加磁場(chǎng)的作用將磁性材料與樣品溶液進(jìn)行分離。最后與高效液相色譜儀結(jié)合，成功應(yīng)用于增香保潤(rùn)劑樣品中合成酚類(lèi)抗氧化劑的定量分析。該方法簡(jiǎn)化了前處理過(guò)程,具有良好的精密度和準(zhǔn)確度,為抗氧化劑的檢測(cè)提供了更快捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent1260型高效液相色譜儀(美國(guó)，安捷倫科技有限公司)；XW-800型渦旋儀(上海漢諾儀器有限公司)；pH計(jì)(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；中低速離心機(jī)(上海外科器械制造廠(chǎng))。

沒(méi)食子酸丙酯(PG)、叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)、叔丁基羥基茴香醚(BHA)和2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%，Aladdin試劑公司)；甲醇(色譜純)；己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇均為優(yōu)級(jí)純，其他試劑均為分析純。磁性納米粒子(本實(shí)驗(yàn)室自制)。

增香保潤(rùn)劑樣品由云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心提供。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取各抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)品50.0 mg，加少量甲醇溶解后，用甲醇定容至50 mL，搖勻，配制成1.0 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(配制時(shí)加入一定濃度的抗壞血酸，可延長(zhǎng)儲(chǔ)備液使用時(shí)間)，用錫箔紙包裹，置于冰箱冷藏保存。使用時(shí)，用甲醇逐級(jí)稀釋成一系列相應(yīng)濃度的工作液。

1.3 磁性納米粒子的制備

取1.69 g硫酸亞鐵銨，1.41 g FeCl3，溶于50 mL純化水后，轉(zhuǎn)移至三頸瓶中，機(jī)械攪拌下水浴加熱至80 ℃，加入5 mL含100 mg癸酸的丙酮溶液，然后加入5 mL濃氨水，氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)30 min。產(chǎn)物用水和乙醇交替洗滌，得到正癸酸包覆的磁性納米顆粒(DA@Fe3O4MNPs)。

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱(150×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為甲醇，B為水(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%冰乙酸)。梯度洗脫程序：0～3 min，50%A;3～4.5 min,50%～85%A;4.5～6.5 min，90%A;9 min以后，A保持在50%不變。流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。

1.5 樣品制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 g增香保潤(rùn)劑樣品，置于100 mL棕色容量瓶中。用50%甲醇稀釋至刻度，定性濾紙過(guò)濾后，得到樣品提取液，備用。

1.6 DLLME-MSPE操作步驟

DLLME-MSPE實(shí)驗(yàn)步驟如圖1。在100 mL燒杯中，加入樣品提取液50.0 mL,加入100 μL正辛醇，渦旋30 s,再加入160 mg/mL的DA@Fe3O3MNPs溶液100 μL,渦旋混勻30 s，用磁鐵靠近燒杯，將DA@Fe3O3MNPs吸在燒杯底部，同時(shí)移除上清液。再向燒杯中加入200 μL 酸性乙腈渦旋解析，再次用DA@Fe3O3MNPs吸在燒杯底部，用注射器吸取解析液。解析液用0.45 μm濾膜過(guò)濾后，進(jìn)行高效液相色譜分析。通過(guò)工作曲線(xiàn)求算抗氧化劑的萃取回收率。

2 結(jié)果與討論

圖1 DLLME-MSPE萃取方式示意圖Fig.1 Schematic diagrams of DLLME-MSPE

2.1 材料的表征

2.1.1透射電鏡(TEM)表征圖2是Fe3O4納米粒子被修飾前后的TEM圖。由圖可知， Fe3O4粒子均呈球形，包覆前(圖2a)微粒粒徑在16 nm左右，包覆后粒徑大小在10 nm左右，且包覆后的粒子較修飾前的分散性得到改善。這是由于修飾材料正癸酸具有較長(zhǎng)的碳鏈，部分微球表面可能有雙層包覆甚至是多層包覆，導(dǎo)致粒徑大小不是很均勻。實(shí)驗(yàn)中采用一步法合成正癸酸磁性微粒，在磁性粒子形成的同時(shí)包覆了正癸酸，由于癸酸分子層的存在而使得粒子間不能直接接觸，避免了團(tuán)聚體的產(chǎn)生，起到穩(wěn)定的作用，使修飾后微粒的粒徑反而有所減小。同時(shí)圖2(b)顯示，納米粒子邊緣的陰影表明正癸酸已包覆在磁性Fe3O4納米粒子表面。

2.1.2傅立葉變換紅外(FT-IR)光譜表征圖3為DA@Fe3O4MNPs(a)和Octanol-DA@Fe3O4MNPs(b)的紅外光譜圖。589 cm-1是Fe-O的伸縮振動(dòng)，在DA@Fe3O4MNPs中，1 632和1 626 cm-1對(duì)應(yīng)于于 C=O 伸縮振動(dòng)，2 924 cm-1處是C-H伸縮振動(dòng)，可以說(shuō)明正癸酸已經(jīng)包覆到Fe3O4MNPs表面。此外圖3b中還有1 521和1 413 cm-1，可能是由于DA@Fe3O4MNPs表面物理吸附辛醇中-OH 的伸縮振動(dòng)而形成的。說(shuō)明正辛醇已被吸附在磁性納米粒子表面。

圖3 DA@Fe3O4 MNPs (a)和正辛醇-DA@Fe3O4 MNPs (b)的傅立葉變換紅外(FI-IR)光譜圖Fig.3 FT-IR spectras of DA@Fe3O4 MNPs(a) and octanol-DA@Fe3O4 MNPs mixture(b)

2.1.3磁性分析采用振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(VSM)測(cè)得Fe3O4和DA@Fe3O4材料的磁滯回線(xiàn)(圖4)。Fe3O4和DA@Fe3O4飽和磁化強(qiáng)度分別為60.50、31.7 emu/g。材料的剩余磁化強(qiáng)度和矯頑力很小，因而具有超順磁性。由于樣品中存在個(gè)別大粒子，可能大于樣品的超順磁臨界尺寸。從而使樣品具有一定的剩余磁化強(qiáng)度和矯頑力。此外由于DA@-Fe3O4表面有雙層甚至是多層癸酸包覆，所以材料的磁性有所減弱，但樣品仍表現(xiàn)為超順磁性[14]。

2.2 DLLME條件的優(yōu)化

2.2.1pH值的影響對(duì)于易受pH影響的化合物而言，與離子性環(huán)境中相比，在非離子環(huán)境中化合物的分配系數(shù)與萃取效率都比較高[15]。為了考察酸度對(duì)萃取的影響，在本實(shí)驗(yàn)中將樣品的pH調(diào)到3.0～11.0范圍之內(nèi)。圖5表明，pH在3.0～7.0范圍之內(nèi)所有目標(biāo)化合物的回收率都未發(fā)生顯著地變化，并且在pH=7.0時(shí)達(dá)到最高萃取率。然而，當(dāng)溶液的pH高于7.0時(shí)，PG和TBHQ的回收率隨著pH的增高而明顯降低。因此，在本實(shí)驗(yàn)中選用pH在3.0～7.0之間進(jìn)行萃取。

圖4 Fe3O4和DA@Fe3O4納米材料的磁滯回線(xiàn)Fig.4 The magnetic hysteresis loops of Fe3O4 and DA@Fe3O4 MNPs

圖5 pH值對(duì)SPAs回收率的影響Fig.5 Effect of pH on recoveries of SPAs

2.2.2萃取劑的選擇本實(shí)驗(yàn)考察了己醇、庚醇、正辛醇、壬醇、癸醇5種萃取劑對(duì)目標(biāo)分析物的萃取效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與其它萃取劑相比,正辛醇對(duì)4種抗氧化劑都有很好的萃取能力。因此,在以下的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,以正辛醇作為萃取劑。

實(shí)驗(yàn)考察了萃取劑正辛醇的體積對(duì)萃取效率的影響。結(jié)果表明，正辛醇體積為100 μL時(shí)，達(dá)到最高萃取率。隨著萃取劑體積的增大，有部分多余的正辛醇無(wú)法被磁性納米子吸附，導(dǎo)致回收率降低；而體積較小時(shí)，對(duì)抗氧化劑萃取不完全，回收率不高。綜合考慮以上情況，本實(shí)驗(yàn)選擇100 μL的正辛醇作為萃取劑。

2.2.3萃取時(shí)間的影響在本實(shí)驗(yàn)中，萃取時(shí)間指的是渦旋時(shí)間，渦旋可以加快萃取達(dá)到平衡的時(shí)間，即從萃取劑加入到樣品中到產(chǎn)生乳化現(xiàn)象的時(shí)間，無(wú)需加入分散劑。選取0～3 min時(shí)間范圍內(nèi)考察渦旋時(shí)間對(duì)萃取效果的影響。結(jié)果顯示，在渦旋輔助乳化萃取中，渦旋時(shí)間超過(guò)30 s以后回收率幾乎沒(méi)有改變，表明在30 s內(nèi)達(dá)到萃取平衡。這說(shuō)明渦旋輔助加速了兩相的傳質(zhì)過(guò)程，提高了萃取效率。因此，選取30 s為最佳萃取時(shí)間。

2.3 MSPE條件的優(yōu)化

2.3.1DA@Fe3O4用量的選擇配制5 mL濃度分別為10 mg/L的SPAs溶液，分別加入4～20 mg磁性納米吸附劑，進(jìn)行4種抗氧化劑的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，磁性納米粒子用量為16 mg時(shí)的回收率明顯優(yōu)于用量為4～12 mg時(shí)，且與用量為20 mg相差不大。因此，對(duì)于SPAs濃度低于10 mg/L的增香保潤(rùn)樣品，DA@Fe3O4吸附劑的用量為16 mg。

圖6 解吸溶劑對(duì)SPAs回收率的影響Fig.6 Effect of eluting solution on recoveries of SPAs

2.3.2解吸溶劑的選擇洗脫劑的種類(lèi)對(duì)目標(biāo)物的解吸有重要影響，因此考察了甲醇、酸性甲醇、乙腈、酸性乙腈、丙酮和酸性丙酮6種有機(jī)溶劑的解吸效果。結(jié)果如圖6所示，甲醇、乙腈、丙酮對(duì)TBHQ、BHA和BHT的洗脫效果不錯(cuò)，但對(duì)PG的洗脫效果較差。酸性甲醇、酸性乙腈和酸性丙酮對(duì)四種抗氧化劑的解吸能力均較強(qiáng)，其中酸性乙腈的效果最好。所以實(shí)驗(yàn)選用乙酸乙腈(1∶99，V/V)作為解吸溶劑。

2.3.3解吸溶劑用量和方式的選擇用0.1%的酸性乙腈洗脫2次(每次0.1 mL)，4種SPAs可完全從磁性納米粒子上解吸下來(lái)。所以，本實(shí)驗(yàn)選擇用酸性乙腈洗脫2次，每次 0.1 mL。在渦旋條件下，研究了解吸時(shí)間(0.5～3 min)對(duì)回收率的影響。在 1 min 時(shí)4種SPAs可完全從DA@Fe3O4上解吸下來(lái)。因此，解吸時(shí)間選擇為1 min。

2.4 方法的線(xiàn)性范圍、檢出限和精密度

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，分別對(duì) 50、100、200、500、1 000 μg/L的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行萃取和測(cè)定。結(jié)果表明(表1)，PG、TBHQ、BHA和BHT在 50～1 000 μg/L 濃度范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)(r)在0.9976～0.9991之間。按信噪比(S/N)=3計(jì)算，4種SPAs檢出限在1.5～6.8 μg/L之間。富集倍數(shù)為245～256倍。圖7所示為增香保潤(rùn)劑樣品和加標(biāo)樣品的色譜圖。

表1 4種SPAs的線(xiàn)性方程、線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)(r)和檢出限Table 1 Linear equations,linear rangs,correlation coefficient,limits of detections(LOD) of 4 SPAs analytical features of the proposed method

2.5 方法的重現(xiàn)性和回收率

在實(shí)際增香保潤(rùn)劑樣品中添加三種不同濃度的SPAs混合標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。分別在日內(nèi)和日間做了平行實(shí)驗(yàn)(n=6),并計(jì)算了相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和目標(biāo)分析物回收率。測(cè)定結(jié)果如表2所示,日內(nèi)和日間RSD分別為3.7%～7.8%、6.9%～13.5%,4種SPAs的加標(biāo)回收率在91.0%～98.4%之間。

圖7 增香保潤(rùn)劑樣品(a)和4種SPAs加標(biāo)濃度為100 μg/L的增香保潤(rùn)劑樣品(b)的色譜圖Fig.7 Chromatograms of humectant sample(a) and sample spiked with SPAs(b) by DLLME-MSPE The spiked concentration of PG,TBHQ,BHA and BHT was 100 μg/L,respectively.

表2 方法的重現(xiàn)性和回收率Table 2 Reproducibility and recovery of the proposed method

3 結(jié)論

本文制備了正癸酸修飾的磁性Fe3O4納米粒子,微粒呈球形,大小一致,粒徑在10 nm左右。用微量的辛醇作為萃取劑，對(duì)增香保潤(rùn)劑中的4種抗氧化劑進(jìn)行萃??；以制備的DA@Fe3O4為吸附劑，對(duì)含有4種合成酚類(lèi)抗氧化劑進(jìn)行吸附，利用納米粒子的磁性達(dá)到快速分離。本方法克服了DLLME中萃取劑選擇范圍小，萃取后萃取劑不易取出的特點(diǎn)，利用疏水性的磁性納米粒子收集萃取劑，加速了萃取過(guò)程并提高了萃取率，同時(shí)還擴(kuò)展了DLLME的應(yīng)用范圍。為增香保潤(rùn)劑中抗氧化劑成分的檢測(cè)提供了切實(shí)可行的方法，也可用于生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量控制。

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沈侯低下頭，吃了幾塊水果，淡淡地說(shuō)：“我媽心氣高，非要逼得我給她掙面子，我懶得看她哭哭啼啼，就先報(bào)個(gè)名，哄哄她?！鄙蚝罨仡^看了一眼，見(jiàn)宿舍門(mén)鎖著，笑著說(shuō)：“你很清楚，我對(duì)學(xué)習(xí)沒(méi)有太多熱情，這四年大學(xué)我可是靠著你讀完的。”

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