發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸工藝研究

魯佩玉，孫青華

(青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東 青島 266000)

氨基酸在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用十分廣泛，例如動(dòng)物飼料添加劑、人類食物調(diào)味品以及化妝品和醫(yī)療產(chǎn)品的原料。氨基酸是生物體中蛋白質(zhì)的組成模塊，對(duì)生物體的代謝途徑和代謝方式起調(diào)節(jié)作用[1]，是生命體的重要組成部分，氨基酸缺乏會(huì)導(dǎo)致人類和動(dòng)物患病[2]。

自1907年開始生產(chǎn)谷氨酸鈉(MSG)以來(lái)，氨基酸的市場(chǎng)需求逐年增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2008年氨基酸市場(chǎng)總額約54億美元[3]，預(yù)計(jì)到2018年底將超過(guò)94億美元。然而，生產(chǎn)氨基酸的工業(yè)技術(shù)仍不完善，需要進(jìn)一步的優(yōu)化。出于這個(gè)原因，許多公司和學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)開始在該領(lǐng)域進(jìn)行研究，目的是尋找更經(jīng)濟(jì)、更環(huán)保的氨基酸生產(chǎn)途徑。

氨基酸可以通過(guò)不同的方法生產(chǎn)，例如從蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中提取、化學(xué)合成、酶促和發(fā)酵途徑。目前工業(yè)上生產(chǎn)的氨基酸大多是通過(guò)發(fā)酵途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的，在需氧或厭氧條件下，利用一種或幾種微生物將底物中存在的糖類轉(zhuǎn)化為廣譜氨基酸，該方法與其他方法相比，具有較大優(yōu)勢(shì)。首先，發(fā)酵法生產(chǎn)的氨基酸對(duì)映體純度較高，減少了后續(xù)的純化步驟；其次，發(fā)酵過(guò)程在相對(duì)溫和的條件下進(jìn)行，能夠防止產(chǎn)品進(jìn)一步降解[4]，且成本較酶促法顯著降低，但是發(fā)酵過(guò)程中需要維持無(wú)菌環(huán)境，攪拌以及補(bǔ)料都會(huì)增加資金投入[5]。

選擇最優(yōu)的氨基酸生產(chǎn)方法，需要參考眾多標(biāo)準(zhǔn)，綜合分析，如可用技術(shù)和資本投資、產(chǎn)品市場(chǎng)規(guī)模和收入、原材料和運(yùn)營(yíng)成本以及每個(gè)特定過(guò)程的環(huán)境影響。然而，由于發(fā)酵法的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)和環(huán)保優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已成為工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)氨基酸最常用的方法。

本文討論了發(fā)酵工藝參數(shù)、與工業(yè)氨基酸生產(chǎn)相關(guān)的技術(shù)問(wèn)題以及可能的改進(jìn)方案，為氨基酸工業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展提供了技術(shù)支撐。

1 氨基酸生產(chǎn)中的工藝設(shè)計(jì)

1.1 過(guò)程監(jiān)控

在發(fā)酵過(guò)程中，需要持續(xù)監(jiān)測(cè)關(guān)鍵參數(shù)和過(guò)程變量，如接種物質(zhì)量、pH、進(jìn)料速率、通氣流量和過(guò)程溫度[6]。Villadsen等證明發(fā)酵過(guò)程中通氣流量(OTR)能夠顯著影響氨基酸產(chǎn)率[7]，增加OTR能夠使L-苯丙氨酸產(chǎn)率提高45%，而OTR增加卻不利于L-色氨酸的生產(chǎn)，可見(jiàn)發(fā)酵過(guò)程中控制OTR意義重大。準(zhǔn)確監(jiān)控和調(diào)整產(chǎn)率還必須仔細(xì)選擇恰當(dāng)?shù)墓に嚋囟龋瑢?duì)谷氨酸棒狀桿菌的研究顯示，高溫(高達(dá)41 ℃)可以提高某些氨基酸如L-谷氨酸的產(chǎn)量[8]。人們還研究了耐高溫細(xì)菌，例如甲醇芽孢桿菌，其可在高達(dá)50 ℃的溫度下產(chǎn)生L-賴氨酸和L-谷氨酸[9]，這些耐高溫細(xì)菌不僅可以增加目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率，還能夠減少發(fā)酵過(guò)程中冷卻水用量，進(jìn)一步節(jié)約成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。此外，發(fā)酵種子液制備是發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵步驟，因?yàn)樗梢燥@著影響菌株的生產(chǎn)力和氨基酸產(chǎn)量。因此，為了確保種子液中菌株的最佳狀態(tài)，菌株的穩(wěn)定性和生產(chǎn)力應(yīng)在轉(zhuǎn)移到主發(fā)酵罐之前進(jìn)行徹底測(cè)試。

1.2 分批補(bǔ)料

氨基酸工業(yè)中最常用的反應(yīng)器操作模式是分批補(bǔ)料操作。該過(guò)程初始僅需要少量培養(yǎng)基和接種物，開發(fā)出預(yù)定的進(jìn)料曲線，獲得更高的產(chǎn)率或產(chǎn)量之后，再將碳源按進(jìn)料曲線加入到反應(yīng)器中。在此過(guò)程中，細(xì)胞和產(chǎn)物都保留在反應(yīng)器中，發(fā)酵所需的營(yíng)養(yǎng)物，如硫酸銨或純氨、生物素、其他維生素，由最初的接種物提供。該模式確保了反應(yīng)器中充足的氧氣容量，以滿足微生物的氧氣需求，從而減少由于氧氣限制而形成的副產(chǎn)物，更好地控制營(yíng)養(yǎng)物的濃度，從而提高氨基酸的產(chǎn)率和產(chǎn)量。Abou-taleb等分別采用分批投料與一次性投料的方式對(duì)芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵，并進(jìn)行對(duì)比[10]，實(shí)驗(yàn)證明，分批補(bǔ)料工藝的總氨基酸濃度比一次性投料工藝高出近1倍。盡管一次性投料在過(guò)程控制和技術(shù)方面相對(duì)簡(jiǎn)單，但與分批補(bǔ)料操作相比，一次性投料產(chǎn)率和重現(xiàn)性均較低，而分批補(bǔ)料操作不僅增加了發(fā)酵的過(guò)程性能，而且提高了發(fā)酵初始含碳量，降低了底物或產(chǎn)物抑制的風(fēng)險(xiǎn)。

1.3 連續(xù)生產(chǎn)

連續(xù)生產(chǎn)的操作模式可以提供比分批補(bǔ)料模式高2.5倍的氨基酸產(chǎn)率和過(guò)程輸出[11]。然而，連續(xù)生產(chǎn)也存在著一定的弊端，連續(xù)的流入和流出，增加了反應(yīng)器受污染的風(fēng)險(xiǎn)，發(fā)酵環(huán)境的連續(xù)改變還可能會(huì)引起菌株退化。Koyoma等以連續(xù)發(fā)酵的方式利用乳酸短桿菌生產(chǎn)L-谷氨酸，并與間歇法進(jìn)行對(duì)比，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)連續(xù)發(fā)酵法較間歇法的L-谷氨酸產(chǎn)量高出1倍[12]。

此外，為了改善連續(xù)生產(chǎn)的性能，可以將多個(gè)生物過(guò)程串聯(lián)。微生物的生長(zhǎng)階段可以在生產(chǎn)過(guò)程以外的反應(yīng)器中進(jìn)行，因而可以對(duì)2個(gè)階段分別進(jìn)行優(yōu)化，此外，高生長(zhǎng)速率可以縮短發(fā)酵時(shí)間，一定程度上可以縮小反應(yīng)器的規(guī)模，增加輸出。

1.4 下游分離純化

有效的下游純化方法對(duì)于降低氨基酸生產(chǎn)成本至關(guān)重要。通常采用離心和過(guò)濾的方法從發(fā)酵液中初步分離氨基酸，再根據(jù)目標(biāo)氨基酸的性質(zhì)，例如溶解度、等電點(diǎn)和吸附性等，選擇合適的色譜方法進(jìn)一步分離純化。然而，由于純化階段所需步驟眾多，每一步都不可避免而造成目標(biāo)產(chǎn)物的損失，這也勢(shì)必造成高純度氨基酸生產(chǎn)成本提高。

由于膜工藝的高選擇性和低熱輸入優(yōu)勢(shì)，引起了人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注，最常見(jiàn)的用于分離目標(biāo)氨基酸的膜分離方法是離子交換膜[13]。為了進(jìn)一步提高過(guò)程性能、降低成本，人們還研究了新的膜過(guò)濾方法，其中納濾是壓力驅(qū)動(dòng)的膜過(guò)濾方法中的一種創(chuàng)新技術(shù)[14]。這些膜可以很容易地與傳統(tǒng)發(fā)酵罐結(jié)合，在同一運(yùn)營(yíng)單元中將生產(chǎn)和凈化相結(jié)合，從而減少資本投資。

1.5 流程建模與分析

氨基酸發(fā)酵工業(yè)的另一個(gè)關(guān)鍵因素是工藝放大。在規(guī)模較大的反應(yīng)器中不同的幾何和物理?xiàng)l件，可能會(huì)影響發(fā)酵的重要參數(shù)，從而導(dǎo)致工藝穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、產(chǎn)率降低，還可能引入更多的副產(chǎn)物，為后續(xù)純化增加困難，影響產(chǎn)品質(zhì)量。尤其是在工業(yè)生產(chǎn)中，微生物發(fā)酵過(guò)程常常受原料混合效率的影響，較低的混合效率與微生物細(xì)胞較高的代謝活性相結(jié)合，導(dǎo)致生物反應(yīng)器中形成局部濃度梯度[15]，對(duì)氨基酸生產(chǎn)造成不利影響，而反應(yīng)器尺寸增加使這個(gè)問(wèn)題更加復(fù)雜。傳統(tǒng)的發(fā)酵罐設(shè)計(jì)通常是將底物從發(fā)酵罐頂部供給，而氣體則從底部供給，底物和氧的濃度梯度沿著反應(yīng)器高度遵循相反的變化趨勢(shì)。在工業(yè)發(fā)酵罐中，由于發(fā)酵罐高度增加，促使底物與氧的濃度梯度更明顯，產(chǎn)生更大的底物和氧耗盡區(qū)，并且發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液體積增大，更強(qiáng)的水壓梯度會(huì)影響氧轉(zhuǎn)移速率，并且使混勻時(shí)間延長(zhǎng)，這使得發(fā)酵罐頂部的微生物同時(shí)暴露于高糖濃度和低氧濃度下，而在底部微生物則暴露于低糖濃度和高氧濃度下[16]。反應(yīng)器中處于高糖濃度和低氧濃度環(huán)境下的微生物會(huì)生產(chǎn)大量乙酸鹽、乙醇、乳酸鹽、氫氣、琥珀酸鹽和甲酸鹽，這些酸產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基酸化，再與攪拌產(chǎn)生的過(guò)量熱一起誘導(dǎo)形成一定的壓力區(qū)域，使該環(huán)境下的微生物不能更好地發(fā)揮作用。為了研究這些參數(shù)對(duì)工業(yè)過(guò)程的影響，已經(jīng)應(yīng)用了諸如計(jì)算流體動(dòng)力學(xué)(CFD)和設(shè)備小試的方法來(lái)進(jìn)行優(yōu)化。

1.5.1 縮小設(shè)備

縮小反應(yīng)器進(jìn)行設(shè)備小試，作為模仿大規(guī)模生物反應(yīng)器條件的工具用來(lái)預(yù)測(cè)產(chǎn)量和產(chǎn)率的變化，受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。雙攪拌釜反應(yīng)器或推流式反應(yīng)器是最常見(jiàn)的反應(yīng)器類型，實(shí)驗(yàn)室中常利用這些設(shè)備來(lái)提供攪拌條件，從而選擇更穩(wěn)定的菌株，增強(qiáng)從小規(guī)模到更大規(guī)模的可轉(zhuǎn)移性[17]。為了獲得大規(guī)模反應(yīng)器的最佳性能預(yù)測(cè)模型，縮小規(guī)模必須根據(jù)工業(yè)過(guò)程的相應(yīng)條件進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整[18]。

1.5.2 流程建模

根據(jù)發(fā)酵工藝操作參數(shù)，工藝化學(xué)計(jì)量和環(huán)境因素的模型[19]，流程建模可以協(xié)助整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中各個(gè)流程的設(shè)計(jì)和優(yōu)化，推算出工藝效率，產(chǎn)物滴度，選擇性以及最佳產(chǎn)率條件。此外，還可以通過(guò)計(jì)算流體動(dòng)力學(xué)方法得到流體混合的抽象數(shù)學(xué)模型，以Reynolds平均的三維Navier-Stokes方程為基礎(chǔ),采用Eulerian-Eulerian法模擬工業(yè)規(guī)模生物反應(yīng)器中流體的湍流特性[20]，最終可以得到有關(guān)流體速度，溫度以及整個(gè)反應(yīng)器中濃度分布的詳細(xì)信息。

將模型獲得的結(jié)果與按比例縮小設(shè)備獲得的數(shù)據(jù)相結(jié)合，可以在開發(fā)的早期階段確定最佳過(guò)程配置，幫助優(yōu)化現(xiàn)有流程，協(xié)助新工藝開發(fā)。這種流程建模的方法盡管在計(jì)算領(lǐng)域已經(jīng)進(jìn)行了多項(xiàng)研究，但還需要更好的模擬器來(lái)支持反應(yīng)器進(jìn)一步放大。

1.5.3 過(guò)程強(qiáng)化

過(guò)程強(qiáng)化(PI)是提高氨基酸發(fā)酵產(chǎn)率的另一個(gè)重要方法，可以使發(fā)酵過(guò)程更安全、更潔凈、更節(jié)能[21]。過(guò)程強(qiáng)化可以通過(guò)2種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)：一種是增強(qiáng)設(shè)備，例如新反應(yīng)器，熱交換器或傳質(zhì)單元；另一種是使用創(chuàng)新的分離方法或技術(shù)來(lái)強(qiáng)化過(guò)程本身[22]，例如將反應(yīng)器配置(操作模式)更改為分批補(bǔ)料反應(yīng)器，可以使賴氨酸產(chǎn)率提高到一次性投料的2倍，在一次投料或補(bǔ)料分批操作之后，將60%或90%的最終發(fā)酵液轉(zhuǎn)移到下游，而另一部分保留在反應(yīng)器中，再將反應(yīng)器用新鮮培養(yǎng)基重新填充至起始工作體積，并定期開始下一次發(fā)酵。減少在系統(tǒng)中引入新接種物所需的時(shí)間和制備無(wú)菌生物反應(yīng)器的停機(jī)時(shí)間，縮短發(fā)酵周期，提高氨基酸生率，工藝的經(jīng)濟(jì)性顯著提高[23]。

膜分離技術(shù)是一種良好的創(chuàng)新分離方法，該方法能夠改善發(fā)酵工藝性能，實(shí)現(xiàn)特定化合物的有效運(yùn)輸。電膜過(guò)濾技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于分離氨基酸，Kumar等已經(jīng)利用L-谷氨酸和L-賴氨酸等電點(diǎn)不同以及所帶電荷相反的性質(zhì)，采用電膜分離技術(shù)成功將兩種氨基酸分離，其中L-谷氨酸的回收率達(dá)到85%，這一實(shí)例證明了該技術(shù)在工業(yè)應(yīng)用中具有巨大潛力。該方法可以將發(fā)酵過(guò)程與分離過(guò)程結(jié)合到同一單元操作中，從而實(shí)現(xiàn)過(guò)程強(qiáng)化。

2 結(jié)論

由于經(jīng)濟(jì)和環(huán)境的優(yōu)勢(shì)以及基因工程技術(shù)的發(fā)展，發(fā)酵成為工業(yè)化生產(chǎn)氨基酸最常用的技術(shù)。優(yōu)化發(fā)酵工藝對(duì)于提高效率、減少成本至關(guān)重要，創(chuàng)新的分離技術(shù)，如納濾膜，可以整合到發(fā)酵罐中，將生產(chǎn)和凈化相結(jié)合。此外，能夠模仿大規(guī)模反應(yīng)器的技術(shù)，如流程建模或縮小設(shè)備，可以減少反應(yīng)器工業(yè)放大引起的諸多問(wèn)題。因此，將流程建模、過(guò)程模擬和代謝工程工具結(jié)合起來(lái)，可以在過(guò)程設(shè)計(jì)早期開發(fā)階段得到最佳工藝參數(shù)，從而最大限度地減少工藝過(guò)程的不確定性。