長鏈非編碼RNA 在精子發(fā)生與卵泡發(fā)育中的研究進展

高 峰，崔清明，陳 晨，朱 吉，彭英林*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，湖南長沙 410128；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長沙 410131）

基因組DNA 經(jīng)過轉錄可以產(chǎn)生兩大類RNA，一類是可以被翻譯成蛋白質的編碼RNA，另一類是不具有或具有較低編碼能力的非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA），ncRNA 通常包括非編碼小RNA（microRNAs、piRNAs、核仁小分子RNA 等，小于200 nt）和長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA，lncRNA，大于200 nt）[1]。近年來，lncRNA 受到越來越多國內外研究學者的關注，更多的功能作用也被揭示。

精子發(fā)生與卵泡發(fā)育在動物繁殖活動中起著至關重要的作用，對重要經(jīng)濟動物的使用年限、產(chǎn)仔性能等有較大影響。本文主要介紹了lncRNA 的基本特征及作用機制，論述了lncRNA 對精子發(fā)生和卵泡發(fā)育的調控機制，并對lncRNA 未來的研究進行展望，為lncRNA 方面的研究提供參考。

1 lncRNA 主要特征及作用機制

根據(jù)染色體上編碼基因的相對位置，將lncRNA 分為正義鏈（sense）、反義鏈（antisense）、雙向（bidirectional）、基因間（intergenic）、內含子間（intronic）[2]。根據(jù)lncRNA 功能所涉及的分子機制又可分為信號原型、誘餌原型、導向原型、支架原型[3]。lncRNA 約為100～100 000 個堿基，并且經(jīng)常通過RNA 聚合酶II/III 進行轉錄[4]。一般來說，lncRNAs 的基因轉錄水平低于蛋白質編碼基因，序列保守性差[5]。然而，保守性差并不一定意味著缺乏功能，正如保守性很差的lncRNA Xist 轉錄本在印跡和X 染色體失活的調控中發(fā)揮關鍵作用。

lncRNA正在成為細胞生物學領域的主要研究對象，其數(shù)量可能超過蛋白質編碼的轉錄物。許多研究表明lncRNAs 起著重要的調控作用，在多種層面上通過多種作用機制調控基因的表達水平，包括染色質修飾[6]、基因組印跡[7]、轉錄[8]、轉錄后調控[9]和翻譯[10]等。根據(jù)其作用方式大致分為3 類：一類是染色質水平，通過對染色質進行表觀修飾調節(jié)基因表達；第二類是轉錄水平，通過改變介導基因表達調控相關因子及酶類的功能，從而調控基因表達；第三類是轉錄后水平，通過與編碼基因或者miRNA 結合，從而調節(jié)mRNA 和miRNA 的表達水平[11]。

在哺乳動物和其他脊椎動物中已鑒定出數(shù)千個lncRNAs，一些lncRNAs 已經(jīng)被廣泛研究，從而揭示了它們可能具有的功能。lncRNAs 的功能通常表現(xiàn)為3種類型的相互作用：RNA-RNA、RNA-DNA 和RNA-蛋白質，所有這些都取決于作用位點的不同[12]。例如，lncRNA 可通過將染色質修飾復合物引導到特定的基因組位點（如Xist）參與各種表觀遺傳調控。lncRNA 還參與轉錄水平的基因表達的控制。lncRNA 還可直接與轉錄因子相互作用，作為誘餌或抑制劑與靶DNA 序列結合。例如，2 種lncRNA 分子Lethe 和p50 相關的Cox-2 基因外RNA（PACER）已經(jīng)顯示出與NF-kB 的不同亞基相互作用，從而阻止它與靶基因的啟動子區(qū)域結合[13]。lncRNA 還可通過與選擇性剪接和染色質結構調節(jié)等生物過程中的蛋白質配偶體相互作用來調控基因的表達。

2 lncRNA 調控精子發(fā)生

雄性的生殖效率在畜牧生產(chǎn)的經(jīng)濟效益中起著關鍵作用，精子發(fā)生是一個連續(xù)而又復雜的高度協(xié)調的細胞逐步增殖、分化的過程，主要包括精原細胞增殖、精母細胞減數(shù)分裂以及精子成熟3 個階段，每一階段都受到多種因素的精密調控，而且需要相關基因的適時表達，才能保證精原細胞順利分化為精母細胞，最終轉變?yōu)榫?。在基因表達層面主要通過內源性、相互性、外源性3 個層次對其進行調控。內源性調控在其中起關鍵性作用，相互性調控以支持細胞間的相互性調節(jié)為主，而外源性調節(jié)主要依靠卵泡刺激素和睪酮等內分泌因素的調節(jié)[14]。有研究表明，ncRNA 參與進行精子形成過程的調控[15]，但是精子發(fā)生過程的調控機制目前還未完全清楚[16]。最近研究表明，lncRNA 在哺乳動物睪丸發(fā)育和精子發(fā)生中是動態(tài)調控的，lncRNA 可能通過遺傳和表觀遺傳機制，在轉錄和轉錄后水平調控基因表達[17]。lncRNA 雖然已經(jīng)在人類[18]、小鼠[19]和豬[20]的睪丸中發(fā)現(xiàn)，然而對其在精子發(fā)生過程中的功能還是知之甚少，因此對lncRNA在精子發(fā)生過程中的研究具有重要意義。

Nakajima 等[21]從體外小鼠胚胎干細胞誘導生殖細胞后激活的早期反應基因的篩選中分離出含有SINEB1F 基序的長鏈非編碼RNA，命名為R53；并通過原位雜交和northern 印跡分析表明，R53 亞片段RNA 具有B1F 基序，由初級轉錄物加工，在成年睪丸中表達，并且在精子發(fā)生過程中主要定位于減數(shù)分裂中期染色質中；此外，注射到小鼠睪丸中的慢病毒介導的RNAi 敲低R53 實驗揭示了后期生殖細胞的顯著減少和幾個后期生物基因的不規(guī)則上調，這表明R53 在精子發(fā)生過程中對關鍵基因的轉錄調控發(fā)揮著不可或缺的作用。

Bao 等[22]利用微陣列技術，對小鼠E12.5、E15.5到P7、P14、P21 和睪丸的性腺上中的lncRNA 進行了深入的表達譜分析，發(fā)現(xiàn)超過2 000 個lncRNA 在2個相鄰時間點的性腺之間差異表達；其對成年睪丸和6 日齡睪丸lncRNA 表達的比較也鑒定出了3 025 個差異表達的lncRNA，并發(fā)現(xiàn)出生后小鼠睪丸中的大多數(shù)lncRNA 變化似乎與減數(shù)分裂過程和精細胞分化同時發(fā)生，因為lncRNA 在2 個時間段內發(fā)生了超過10 倍的變化（P21 與P14 以及成年與P21），這表明lncRNA的調控在精子發(fā)生的減數(shù)分裂后期和單倍體時期是最具活力的。

除了以上例子外，還有其他lncRNA 也被發(fā)現(xiàn)參與精子發(fā)生過程，例如Mrhl[23-25]、Tsx[26]、Dmr[27]和SpgalncRNA[28]等。lncRNA 在睪丸中含量豐富，遠遠超過了mRNA 的數(shù)量和種類，這些豐富的lncRNA 在睪丸中對精子發(fā)生的調控機制仍有待進一步探索。

3 lncRNA 調控卵泡發(fā)育

卵泡是卵巢的基本功能單位，由位于中間的卵母細胞和四周的顆粒細胞構成。卵泡的發(fā)育實際上是卵母細胞和周圍的顆粒細胞及卵泡膜細胞互相調控的過程，卵泡發(fā)育是一個有序、漸進、復雜的生理過程。在卵泡發(fā)育生長過程中，卵泡經(jīng)歷靜止期卵泡（始基卵泡、初級卵泡、次級卵泡）、生長卵泡期（竇前卵泡、早期竇卵泡）、成熟期卵泡（選擇卵泡、成熟卵泡）3 個時期，其形態(tài)和功能也隨著發(fā)育時相的變化而不斷變化[29]。在卵泡發(fā)育的不同階段，除了卵泡形態(tài)和功能發(fā)生變化外，其精細調控過程的分子機制還涉及顆粒細胞與卵細胞間的信號傳遞，同時包括眾多的基因/蛋白均參與其中[30]。有研究表明，lncRNA 可通過影響顆粒細胞增殖、分化與凋亡等在排卵、黃體形成和早期胚胎發(fā)育等階段發(fā)揮重要作用[31]，因此對lncRNA 的深入研究有助于進一步了解卵泡及早期胚胎發(fā)育的分子機制。

李夢尋等[32]采用RACE 技術對lncRNA-ENSSSCT 00000018610 的全長序列進行了擴增克隆，用Realtime PCR 進行組織表達譜分析，分析其在梅山豬和杜洛克豬卵泡中的表達情況并采用順式和反式2 種方法對lncRNA-ENSSSCT00000018610 靶基因進行預測，克隆獲得了lncRNA-ENSSSCT00000018610 全長1 731 bp；lncRNA-ENSSSCT00000018610 在肌肉、心、肝、脾、肺、腎、十二指腸、卵巢、輸卵管、子宮、垂體、黃體、下丘腦中均有不同程度的表達，其中腎、肺、子宮、卵巢表達量相對較高；lncRNA-ENSSSCT00000018610 在梅山豬M2 卵泡中的表達量高于S、M1、L 卵泡，在杜洛克豬M1、M2 卵泡中的表達量極顯著高于S 和L 卵泡，提示該lncRNA 可能與卵泡發(fā)育有關。并且通過lncRNA 與蛋白編碼基因表達相關性（co-expression）預測得到其潛在靶基因CYP2J2、SCARB1、HSD3B1、HSD17B2、HSD17B7 參與卵巢類固醇激素合成信號傳導，參與卵泡發(fā)育及排卵過程，COL11A2、FGFR1、IBSP 參與PI3K-Akt 信號通路，而PI3K-Akt 通路在哺乳動物卵泡發(fā)生和排卵的過程中起著關鍵的調控作用，提示其可能通過對靶基因的調控間接參與卵泡發(fā)育過程。

李加宇[33]研究結果顯示，在小鼠多種組織中有9個lncRNA 表 達 較 高，其 中l(wèi)ncRNA647、lncR147、lncRNA274 在發(fā)情8 周及發(fā)情后期卵巢中有特異性高表達；轉染lncRNA274 使lncRNA274 過表達發(fā)現(xiàn)卵泡發(fā)育相關基因上調，排卵次數(shù)增多；同時構建以lncRNA274 為靶基因的轉基因小鼠，經(jīng)表型分析，其后代數(shù)量明顯增加。這些實驗結果表明lncRNA274 具有促進排卵、促進卵泡發(fā)育的作用。

利用基因工程小鼠模型，York 等[34]研究了一種新的調節(jié)因子GAS2 在卵泡發(fā)育過程中的體內功能，證明了GAS2 主要表達于卵巢體細胞室，雌性GAS2 缺失小鼠的生殖能力低下，卵母細胞囊腫破裂，竇卵泡和黃體數(shù)量減少，生長卵泡周圍基底膜組織嚴重受損。此外，還證實了GAS2 缺失會使卵巢中Notch 信號活性失調，并強調了GAS2 和Notch 信號通路在卵巢發(fā)育過程中的相互作用[34]。總的來說，證明了GAS2 在小鼠出生前后卵母細胞囊腫的破裂和后期的卵泡ECM 重建中發(fā)揮了不可或缺的作用。

4 展 望

家畜精子發(fā)生和卵泡發(fā)育等對畜牧業(yè)發(fā)展起到舉足輕重的作用，研究學者已經(jīng)對精子發(fā)生及卵泡發(fā)育中相關lncRNA 開始了一系列的研究，盡管目前研究工作大多停留在lncRNA 鑒定上，很多機制研究尚不成熟，但不可否認的是lncRNA 具有多種潛在的重要功能，因此需要深入研究其對家畜繁殖等重要經(jīng)濟性狀的調控作用機理，深層次理解家畜繁殖機制，為改善家畜繁殖力提供重要的理論基礎。目前對lncRNA 的研究多集中在小鼠上，一些哺乳動物（豬、牛、羊）研究較少，雖然小鼠可作為哺乳動物研究的重要模型，但相同lncRNA 在小鼠中的功能機制是否和在哺乳動物中完全一致還有待研究。