氧化反應對肌肉滴水損失的影響及抗氧化劑對其調控機制的研究進展

王 波，羅海玲

（中國農業(yè)大學動物科學技術學院，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193）

水分是肌肉組織的主要組成部分，含量約為75%。肌肉的儲水能力通常用系水力進行評估，并通過測定滴水損失反映肌肉系水力。屠宰后，肌肉組織的生理狀態(tài)發(fā)生改變，肌肉束縛水能力下降，肌肉內水分受到重力作用自然緩慢滲出造成的重量損失稱為滴水損失。對生產者而言，滴水損失嚴重影響屠宰后肉品質以及加工后的產量；對消費者而言，滴水損失會影響消費者對肉產品的接受度。以羊肉為例，2017 年我國羊肉產量為468 萬t（《中華人民共和國2017 年國民經濟和社會發(fā)展統計公報》），羊肉均價按60 元/kg 計算，滴水損失每降低0.1%，就會造成高達約2.8 億元的經濟損失。滴水損失常發(fā)生在宰后的存儲期，隨存儲時間延長而增加[1]。宰后肌肉不可避免地會發(fā)生氧化反應，并導致滴水損失增加，在存儲期，所發(fā)生的氧化反應主要包括脂質氧化和蛋白氧化2類，且影響肉品質、感官特性以及安全性[2-5]。人工合成抗氧化劑或植物提取物類抗氧化劑均對肌肉的氧化反應有抑制作用，但由于人工合成抗氧化劑存在安全性和副作用等不確定因素，天然植物提取物類的抗氧化劑則因其綠色安全等特性越來越受到重視[6-7]。因此，通過天然植物提取物類抗氧化劑抑制脂質和蛋白氧化是一種值得探討的降低滴水損失途徑。本文對近年來通過植物提取物調控肌肉抗氧化能力進而影響滴水損失的研究進行綜述，為進一步研究抗氧化劑調控氧化反應與滴水損失提供參考。

1 滴水損失的形成原因及影響因素

1.1 滴水損失成因 在肌肉中水分以自由水、結合水和不易流動水3 種形式存在。自由水主要存在于肌細胞外且能自由流動，約占總水分的10%～15%，這部分水在動物屠宰后快速流失。結合水（低于10%）通過靜電引力作用和蛋白質分子表面緊密結合，屠宰后較難流失。不易流動水（約80%）主要以不易流動的形式存在于肌纖維中，這部分水是肌肉滴水損失的主要來源。在活體的肌肉組織中，肌原纖維蛋白在肌纖維中形成的網格結構為儲存水分提供空間。而屠宰后，肌細胞由有氧呼吸轉化為糖酵解過程，產生大量乳酸，造成pH 降低（從約7.0 降低到5.3～5.8）[8]；進而蛋白達到等電點，降低蛋白的靜電作用，產生蛋白凝集現象，肌原纖維發(fā)生橫向收縮，纖維蛋白空間結構被擠壓，水分存儲空間縮小，使得其中的水分滲出，形成滴水損失[9]。

1.2 影響滴水損失的因素 滴水損失是肉品質評價的重要組成部分，肉品質由遺傳和環(huán)境因素共同調控[10]。肉品質的遺傳力只有0.1～0.2[11]，因而僅通過遺傳選擇對肉品質進行調控是非常漫長的。日糧營養(yǎng)物質供給是環(huán)境因素的重要組成部分，通過日糧營養(yǎng)調控肉品質是一種快速有效的方法。有研究表明，日糧中能量[12]、蛋白[13]、脂肪[14]、氨基酸[15]、礦物質[16]、維生素[17]等以及肌肉靜電荷、肌肉收縮、蛋白質降解以及鈣蛋白酶系統等[18-19]均會引起宰后滴水損失的改變。此外，加工因素如冷卻工藝、溫度、包裝等也會對滴水損失產生影響[20]。然而，無論是營養(yǎng)因素或加工因素均可能通過影響氧化反應調控滴水損失，進而影響肉品質，因此氧化反應對滴水損失的調控值得關注和研究。

2 氧化反應對滴水損失的影響

動物宰后機體發(fā)生一系列變化，主要包括血液和營養(yǎng)物質循環(huán)的停止，pH 下降，自身預防性抗氧化酶逐漸失效，清除Fe 的急性時相蛋白（Acute-Phase Proteins）（血漿銅藍蛋白、轉鐵蛋白和結合珠蛋白）無法發(fā)揮活性，肌漿內質網喪失鈣存儲能力，鈣依賴蛋白酶開始降解蛋白，膜脂氧化反應啟動等[21]。這些變化引起脂質氧化和蛋白氧化反應的發(fā)生，并進一步影響了肌肉的滴水損失。

2.1 脂質氧化對滴水損失的影響 除微生物變化之外，脂質氧化是最先對肉品質產生影響的反應過程[22]。屠宰后，脂質氧化起始于細胞中膜結構磷脂雙分子層中的多不飽和脂肪酸，脂質發(fā)生氧化反應不僅會對肌肉的紋理、風味、肉色、營養(yǎng)價值以及安全性造成負面影響[23]，而且可以影響肌原纖維蛋白的保水能力，使肌肉的系水力降低[24]。因而，細胞膜和細胞器膜上的不飽和脂肪酸、脂蛋白等物質對維持肌細胞的結構具有重要作用，一旦破壞引起肌纖維結構和通透性改變，不利于水分存儲。完整的細胞膜能夠一定程度減緩氧化反應的發(fā)生，防止或抑制自由基產生，從而降低滴水損失[25]。任何破壞細胞膜完整性的操作（如剔骨、分割等）均會促進組織產生自由基，使得不飽和脂肪酸的氧化作用加強，細胞膜結構狀態(tài)改變[26]。因而，脂質氧化通過影響肌原纖維的保水能力及細胞膜的完整性，增加肌肉滴水損失。通常用硫代巴比妥酸反應物（Thiobarbituric Acid-Reactive Substances，TBARS）評價脂質氧化的程度。研究證實，滴水損失與TBARS 含量呈正相關，且隨肌肉脂質氧化程度上升而增加[24]。

2.2 蛋白氧化對滴水損失的影響 除水分外，蛋白質是肌肉中含量最高的物質，也是細胞骨架的主要組成成分，對維持肌細胞的空間結構有重要作用。蛋白質氧化是指蛋白質發(fā)生共價修飾，主要包括由活性氧直接引起的修飾和由氧化應激的次級產物間接作用產生修飾。其中，堿性氨基酸氧化后產生羰基，并與游離的氨基反應產生酰胺鍵[27]。半胱氨酸的巰基會隨著氧化反應而產生二硫鍵[28]。特異性蛋白側鏈或肽骨架發(fā)生共價修飾導致蛋白特性發(fā)生改變，包括斷裂、聚合、溶解度下降、功能喪失以及低敏感蛋白酶解性等。羰基化合物含量通常用來評價蛋白質氧化的程度[29]。屠宰后，隨儲存時間延長，肌肉中羰基含量逐漸增加，蛋白質的氧化程度上升。研究表明，滴水損失與肌肉中羰基含量呈正相關，與巰基含量呈負相關[24]。因而，蛋白質發(fā)生氧化反應不利于宰后肌肉水分的保存[30]。也有研究顯示，蛋白質中酸性氨基酸側鏈氨基的丟失可以導致電子重新分配并改變肌原纖維蛋白的等電點，最終降低肌肉系水力[31]。雖然目前已經發(fā)現氧化反應影響肌原纖維蛋白（原肌球蛋白、肌球蛋白、肌原蛋白、肌動球蛋白等）的修飾或構象，但目前關于肌原纖維蛋白的修飾和結構變化與肌肉滴水損失之間的關系尚不十分明確[32]。不同的肌原纖維蛋白在維持肌細胞構象中起著不同的作用，因而，氧化反應引起不同肌原纖維蛋白改變時，最終引起滴水損失改變的過程也有所差異。其中肌球蛋白具有ATP 酶活性，可以通過促進ATP 的水解為肌肉收縮供能[33]，發(fā)生氧化反應時可以引起肌球蛋白磷酸化，磷酸化修飾后的肌球蛋白能夠提高其ATP 酶活性，進而加強肌肉收縮，增加滴水損失[34]。氧化反應影響肌纖維結構，造成肌原纖維斷裂，肌原纖維斷裂主要發(fā)生在Z 線附近，并且Z 線附近的肌纖維蛋白（肌線蛋白、紐蛋白等）降解可以為水分的存儲提供空間，增加水分存儲能力，進而降低滴水損失[35-36]。

3 抗氧化劑調控滴水損失的機制

抗氧化劑主要通過抑制自由基的產生或阻斷自由基的傳遞延緩自氧化過程，從而發(fā)揮其抗氧化的作用。主要作用方式包括：①清除引發(fā)過氧化反應的物質；②螯合金屬離子，阻斷活性物質產生或脂質過氧化物分解；③抑制超氧陰離子，阻止過氧化物的生成；④破壞自氧化鏈的進行；⑤降低局部氧含量[37]。常見抗氧化劑主要包括黃酮類、多酚類、類胡蘿卜素類以及生育酚，這些抗氧化劑可以抑制金屬離子引起的氧化反應，清除自由基，從而發(fā)揮著還原劑的功效[38]。從結構上看，黃酮類和多酚類結構類似，類胡蘿卜素和生育酚結構相近。本團隊前期研究結果證實甘草提取物（Licorice Extract，黃酮類）[39]和維生素E（Vitamin E，生育酚）[17]等都可降低羊肉滴水損失。不同類型抗氧化劑的作用途徑和效果存在一定差異。

3.1 甘草提取物對滴水損失的調控 甘草提取物中的植物活性成分主要包括三萜類、多糖類以及黃酮類化合物。其中，主要發(fā)揮抗氧化功能的成分為甘草黃酮。體外試驗結果表明，隨著甘草提取物濃度提高，其清除苯基-2-三硝基苯肼（α, α-Diphenyl-β-Picrylhydrazyl，DPPH）和2，2′-二氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（2, 2′-Azino-Bis-3ethyl-Benzthiazoline-6-Sulfonic Acid，ABTS）自由基的能力顯著提高，且作用效果呈現劑量依賴效應[40]。體內試驗發(fā)現，日糧中添加甘草提取物顯著提高肌肉過氧化氫酶（Catalase，CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GPx）酶活，進而加強清除氧化陰離子自由基能力，提高肌肉的抗氧化性能[40]。在成熟期，抗氧化酶逐漸失活，非酶抗氧化劑如黃酮、維生素E 和谷胱甘肽（Glutathione，GSH）含量也隨著日糧中添加適宜水平甘草提取物而升高。這與黃酮通過提供氫離子將GSH 從氧化狀態(tài)轉化成還原態(tài)有關[41-42]。且黃酮可以降低肌肉中TBARS 和活性氧簇（Reactive Oxygen Species，ROS）水平，抑制脂質氧化反應。因而，黃酮可以通過提高肌肉抗氧化酶濃度和抑制脂質氧化來降低肌肉滴水損失。此外，甘草提取物提高了宰后肌肉中鈣蛋白酶酶活，促進肌肉蛋白質的水解；且鈣蛋白酶活性與滴水損失呈負相關，鈣蛋白酶活性提高，降低了滴水損失[40]。鈣蛋白酶主要分布在Z 線附近，鈣蛋白酶活性增加，促進了Z 線附近的肌線間蛋白降解（肌線間蛋白含量與滴水損失呈正相關[43]），肌線間蛋白的降解為水分存貯提供了空間，從而降低滴水損失[40]。關于其他細胞骨架蛋白（如紐蛋白、踝蛋白、肌動蛋白等）對滴水損失的調控作用目前尚不明確，有待進一步研究。

3.2 維生素E 對滴水損失的調控 維生素E 是一種脂溶性維生素，其抗氧化功能對保護脂蛋白、多不飽和脂肪酸、細胞膜和細胞器膜完整性具有重要作用[44]。其發(fā)揮抗氧化作用的主要方式為清除自由基，維持細胞膜完整性[45]。本團隊前期研究表明，羊肉中總抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity，T-AOC）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、GPx 和CAT活性隨著日糧中添加維生素E（200、400 mg/kg）而顯著提高，同時肌肉中維生素E 含量也顯著提高[20]。Kazeem 等[24]研究指出，滴水損失與肌肉中維生素E含量呈顯著負相關。因而，日糧中添加維生素E 可以通過增加肌肉抗氧化酶活性及維生素E 含量，提高肌肉抗氧化能力，從而降低滴水損失。進一步研究發(fā)現，肌肉中TBARS 和羰基含量顯著下降，表明屠宰后脂質和蛋白質氧化反應均受到日糧中添加維生素E 的抑制，減緩肌肉的氧化反應，減小滴水損失[17]。

α- 生育酚是維生素E 的一種主要活性形式，是人類和動物機體必須的營養(yǎng)素。由于其苯環(huán)上的酚羥基具有很高活性，可以快速與過氧化自由基產生反應，而降低過氧化自由基與其他分子的反應；α-生育酚可帶走氧化脂肪酸過程中的氧化自由基，阻斷進一步的自由基反應，且自身轉化為相對穩(wěn)定的自由基。因而，α-生育酚具有較強的抗氧化性能。

本團隊通過蛋白組分析發(fā)現，α- 生育酚可以通過多種途徑綜合作用調控宰后滴水損失：①上調抗氧化酶（NDUFS7 等）表達量，抑制自由基傳遞，增強抗氧化性能；②上調參與機體的代謝酶（SUCLA2、SUCLG2、ALDH1A1、PSMA3 等），一方面增加機體ATP 的產生，為加快電子清除供能，另一方面通過蛋白酶體途徑促進肌纖維蛋白的降解，抑制滴水損失；③上調鈣通道相關蛋白（CACNB1），增強鈣蛋白酶活性，減少滴水損失；④下調結構蛋白（如TPM3、TNNC1、MYL2、MYL4 等）參與肌肉收縮通路，一方面減少肌球蛋白的凝聚，另一方面結構蛋白的下調為水分貯存提供空間，從而抑制存貯期滴水損失[20]。

4 展 望

脂質氧化反應和蛋白質氧化反應均通過提高肌肉的滴水損失降低了肉品質，造成巨大經濟損失。通過日糧中添加抗氧化劑有利于增強宰后肌肉的抗氧化性能，抑制或減緩氧化反應發(fā)生。抗氧化劑主要通過影響宰后肌肉抗氧化酶、脂質氧化和蛋白質氧化、鈣蛋白酶以及蛋白降解等方式調控宰后滴水損失。但肌細胞骨架蛋白和肌原纖維蛋白成分降解對滴水損失的影響有待進一步研究，從而完善滴水損失的調控機制，為更合理地調控滴水損失，進而改善肉品質，提供理論指導。