微小RNA-155-5p通過靶向組蛋白去乙酰化酶1調(diào)控鼻黏膜上皮細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的實驗研究

王忠巧, 高 妍, 司峰志

(新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 耳鼻喉科, 新疆 烏魯木齊, 830000)

慢性鼻竇炎伴鼻息肉(CRSwNP)是耳鼻喉科常見的慢性炎癥性疾病，發(fā)病率逐年升高，治療效果欠佳[1]。CRSwNP病因復雜，機制尚不清楚，研究[2]表明，鼻腔黏膜上皮細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在CRSwNP發(fā)生中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，因此探索鼻腔黏膜上皮細胞EMT過程，對于防治CRSwNP具有一定意義。微小RNA(miRNA)是一類非編碼RNA，在調(diào)控細胞新城代謝中扮演重要角色。多種miRNA在CRSwNP組織中差異表達，可調(diào)控鼻腔黏膜上皮細胞的生物學功能[3-5]。miR-155-5p參與調(diào)控多種疾病的EMT過程[6]。研究[7]表明, miR-155-5p可通過靶向凋亡誘導因子促進腎癌細胞的轉(zhuǎn)移及EMT過程。但miR-155-5p是否可調(diào)控鼻腔黏膜上皮的EMT過程尚不清楚。本研究通過臨床組織標本、細胞學實驗觀察miR-155-5p對鼻腔黏膜細胞EMT的影響，分析其與組蛋白去乙酰化酶1(SIRT1)的關(guān)系，以期為CRSwNP的防治提供新靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年5月—2021年12月行鼻內(nèi)鏡手術(shù)治療的患者50例為研究對象，其中男33例，女17例; 年齡18～66歲，平均(41.58±7.34)歲。納入標準: 年齡大于18周歲者; 近2周內(nèi)未使用抗生素、過敏藥物、激素、免疫抑制劑等藥物者; 對研究知情同意者。排除標準: 上頜竇后鼻孔息肉、霉菌性鼻竇炎、鼻咽癌等患者; 合并其他部位感染性疾病、敗血癥等疾病者; 合并過敏性疾病者; 合并自身免疫性疾病者; 合并惡性腫瘤者。根據(jù)是否合并鼻息肉分為CRSwNP組36例，慢性鼻竇炎不伴鼻息肉(CRSsNP)組14例。CRSwNP組患者男24例，女12例; 年齡18～64歲，平均(42.34±7.19)歲。CRSsNP組患者男9例，女5例; 年齡18～67歲，平均(42.21±6.83)歲。選取同期行鼻中隔偏曲手術(shù)治療的20例鼻中隔偏曲患者為對照組，其中男11例，女9例; 年齡18～66歲，平均(42.44±87.74)歲。3組患者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 具有可比性。無菌條件下收集3組患者的鼻腔黏膜組織, -80 ℃保存待測。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 細胞、試劑及儀器

人鼻黏膜上皮細胞(HNEPC，長沙豐暉生物有限公司), RPMI-1640培養(yǎng)基(BI, 以色列), miR-155-5p mimics、miR-155-5p inhibitor、陰性對照miR-NC、Vector質(zhì)粒及引物(廣州銳博生物有限公司)，野生型SIRT1載體(SIRT1-WT)、突變型SIRT1載體(SIRT1-MUT)(天津擎科生物有限公司), Lipofectamine 3000、TRIzol(Thermo公司，美國)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒(Tarkara公司，日本),SIRT1、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、纖黏蛋白(Fibronectin)及β-actin兔抗人抗體, Cy3標記的山羊抗兔二抗(武漢博士德生物有限公司，天津天裔生物有限公司)，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(北京Solarbio公司)，酶標儀(南京貝燈醫(yī)療器械有限公司), PCR儀(ABI公司，美國)。

1.3 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

HNEPC細胞使用RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。將miR-155-5p mimics、miR-155-5p inhibitor、miR-NC及Vector質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至細胞記為miR-155-5p組、miR-155-5p inhibitor組、miR-NC組、Vector組。

1.4 免疫熒光檢測鼻腔黏膜組織、細胞E-cadherin、Vimentin、α-SMA、Fibronectin表達

將組織制備成5 μm的切片, 70 ℃烤箱過夜，依次通過二甲苯、梯度酒精進行脫蠟，將切片放在檸檬酸或乙二胺四乙酸(EDTA)中，高壓進行熱修復抗原，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次, 5%山羊血清封閉，室溫下1 h, 加入一抗, 4 ℃冰箱過夜，第2天, PBS洗滌3次，加入熒光二抗，室溫避光孵育1 h, PBS洗滌3次，二脒基苯基吲哚(DAPI)室溫孵育15 min, PBS洗滌3次，封片，熒光顯微鏡下觀察。制備細胞爬片, 4%多聚甲醛固定10 min, PBS洗滌3次，其他步驟同上。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測細胞、組織miR-155-5p、SIRT1 mRNA表達水平

將各組組織從冰箱中取出，在液氮中研磨。取對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化，離心。加入1 mL Trizol, 利用一步法提取總RNA, 檢測RNA濃度、純度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 反應條件為: 30 ℃ 10 min, 42 ℃ 30 min, 99 ℃ 5 min, 4 ℃ 5 min。按照熒光定量試劑盒說明進行PCR, 循環(huán)條件: 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 34 s, 共40個循環(huán)，構(gòu)建溶解曲線，相對表達量用2-△△Ct法計算。內(nèi)參使用U6。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 Western blot檢測組織、細胞SIRT1、E-cadherin、Vimentin、α-SMA、Fibronectin的蛋白表達

收集各組細胞或組織，加入蛋白裂解液提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)測蛋白濃度。配制5%濃縮膠及10%分離膠，每孔中加入20 μg蛋白, 70 V電壓下將蛋白轉(zhuǎn)移到聚氟乙烯(PVDF)膜上, 5%脫脂奶粉室溫封閉1 h, 加入SIRT1(1∶1 000)、E-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶1 000)、α-SMA(1∶1 000)、Fibronectin及β-actin(1∶1 000), 4 ℃冰箱過夜，第2天PVDF膜洗滌3次，加入對應的二抗室溫孵育1 h, 洗滌3次，加入發(fā)光液，上機曝光，使用Image J軟件分析條帶灰度值，用目的蛋白/β-actin的比值表示蛋白的相對表達量。

1.7 在線網(wǎng)站預測miR-142-3p與SIRT1的靶向關(guān)系

使用TargetScan在線網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/)預測miR-142-3p與SIRT1的靶向關(guān)系。

1.8 熒光素酶報告實驗

將Vector、miR-155-5p mimics質(zhì)粒分別與SIRT1-WT、SIRT1-MUT載體共轉(zhuǎn)染至293T細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，檢測各組細胞熒光素酶相對活性。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 CRSwNP、CRSsNP及正常鼻腔黏膜組織miR-155-5p表達

CRSwNP組鼻腔黏膜組織miR-155-5p表達水平高于CRSsNP組及對照組, CRSsNP組鼻腔黏膜組織miR-155-5p表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1。

2.2 CRSwNP、CRSsNP及正常鼻腔黏膜組織E-cadherin、Vimentin、α-SMA、Fibronectin及SIRT1表達

CRSwNP組鼻腔黏膜組織E-cadherin、SIRT1表達水平低于CRSsNP組及對照組, CRSsNP組鼻腔黏膜組織E-cadherin、SIRT1表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CRSwNP組鼻腔黏膜組織Vimentin、α-SMA、Fibronectin表達水平高于CRSsNP組及對照組, CRSsNP組鼻腔黏膜組織Vimentin、α-SMA、Fibronectin表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。見圖2。

2.3 各組細胞miR-155-5p表達水平

miR-155-5p組細胞miR-155-5p表達水平為(4.73±0.23), 高于Vector組的(1.03±0.03), miR-155-5p inhibitor組miR-155-5p表達水平為(0.32±0.02), 低于miR-NC組的(1.02±0.04)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4 miR-155-5p對細胞EMT過程的影響

miR-155-5p組細胞E-cadherin表達水平低于Vector組, Vimentin、α-SMA、Fibronectin表達水平高于Vector組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。miR-155-5p inhibitor組細胞E-cadherin表達水平高于miR-NC組, Vimentin、α-SMA、Fibronectin表達水平低于miR-NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖3。

2.5 miR-155-5p與SIRT1的靶向關(guān)系

生物信息學分析發(fā)現(xiàn), miR-155-5p與SIRT1mRNA 3′-UTR存在結(jié)合位點。miR-155-5p+SIRT1-WT組細胞SIRT1表達水平低于Vector+SIRT1-WT組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。miR-155-5p組細胞SIRT1表達水平低于Vector組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。miR-155-5p inhibitor組細胞SIRT1表達水平高于miR-NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖4。

3 討 論

慢性鼻竇炎是鼻腔黏膜慢性炎癥為特征的疾病，根據(jù)是否合并息肉可分為CRSwNP、CRSsNP。近年來, CRSwNP發(fā)病率逐年升高，且治療效果不佳，給患者的生活質(zhì)量造成嚴重影響，因此探討其分子機制迫在眉睫。EMT是指上皮細胞在各種刺激下發(fā)生向間質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)化的過程，在細胞增殖、侵襲及遷移中扮演重要角色。鼻腔上皮黏膜細胞受到炎癥因子的刺激后會發(fā)生EMT過程，輕度EMT是上皮細胞正常、必要的過程，有利于抵御炎癥反應，但炎癥持續(xù)刺激引起的EMT可導致組織病理改變，最終形成CRSwNP。目前，多數(shù)學者認為, CRSwNP中存在EMT現(xiàn)象[8]。研究[9-11]發(fā)現(xiàn), CRSwNP黏膜組織高表達EMT相關(guān)標記物。本研究結(jié)果顯示，正常鼻腔黏膜組織、CRSsNP及CRSwNP中EMT過程越來越顯著，提示EMT參與了CRSwNP發(fā)生發(fā)展過程，再次驗證了其他人的研究結(jié)果。

miRNA是一類非編碼RNA, 調(diào)控細胞的多種生物學功能。研究[12-14]表明，多種miRNA在CRSwNP鼻黏膜組織中差異表達。miR-155-5p是最近發(fā)現(xiàn)的一種miRNA, 參與調(diào)控細胞的增殖、凋亡，促進腫瘤細胞EMT過程及轉(zhuǎn)移。研究[15]發(fā)現(xiàn)，miR-155-5p通過靶向GSK-3β抑制放療誘導的肺纖維化的EMT過程。此外, miR-155-5p可通過調(diào)控EMT過程，促進口腔癌進展。但關(guān)于miR-155-5p在CRSwNP中的功能及作用機制仍不清楚。HNEPC是鼻腔抵御病原體、過敏原等各種有害刺激的重要屏障，在CRSwNP的炎癥反應和鼻息肉的形成中扮演著重要角色，同時HNEPC過度增殖是鼻息肉形成的關(guān)鍵。本研究通過臨床標本觀察了miR-155-5p表達情況，結(jié)果顯示, CRSwNP組織中miR-155-5p表達水平顯著高于正常鼻腔黏膜組織及CRSsNP組，提示miR-155-5p參與了CRSsNP的發(fā)生發(fā)展過程。為進一步驗證miR-155-5p與EMT的關(guān)系，本研究構(gòu)建了過表達、敲低miR-155-5p質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染至HNEPC細胞，結(jié)果顯示，上調(diào)miR-155-5p可促進細胞的EMT過程；反之，沉默miR-155-5p可抑制細胞的EMT過程，提示miR-155-5p可能通過調(diào)控鼻腔上皮黏膜細胞的EMT過程，參與鼻息肉的發(fā)生。

miRNA一般通過與下游的靶基因3′-UTR結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達進而發(fā)揮作用。為進一步探討miR-155-5p調(diào)控CRSwNP炎癥反應的可能機制，本研究首先通過生物信息學預測了miR-155-5p靶基因，發(fā)現(xiàn)SIRT1基因mRNA 3′-UTR與miR-155-5p存在互補的堿基對。SIRT1屬于Sirtuin蛋白家族中的明星分子，在呼吸道炎性疾病、肺纖維化疾病中發(fā)揮重要作用[16-17]。研究[18]發(fā)現(xiàn),SIRT1與TGF-β1誘導EMT過程密切相關(guān), TGF-β1可抑制細胞SIRT1表達，而上調(diào)SIRT1可抑制TGF-β1誘導的EMT過程。研究[9]發(fā)現(xiàn), CRSsNP組織中低表達SIRT1,SIRT1可抑制鼻黏膜上皮的EMT過程。本研究結(jié)果顯示, CRSwNP組織中SIRT1表達水平顯著低于正常鼻腔黏膜組織及CRSsNP組，提示SIRT1在CRSwNP發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。LEE M Y等[19]發(fā)現(xiàn),SIRT1在CRSwNP中低表達,SIRT1可通過下調(diào)缺氧誘導因子1α(HIF-1α)的活性抑制EMT, 從而抑制鼻息肉的形成。研究[20-21]發(fā)現(xiàn)，多種miRNAs可靶向SIRT1調(diào)控細胞的EMT過程。因此，本研究采用熒光素酶實驗進一步驗證miR-155-5p對SIRT1的直接調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明, miR-155-5p與SIRT1具有負性靶向調(diào)控關(guān)系。上述結(jié)果證實,SIRT1是miR-155-5p靶基因, miR-155-5p可靶向抑制SIRT1表達，進而促進鼻腔黏膜上皮細胞的EMT過程。但本研究存在一定的局限性，首先本研究入選病例數(shù)較少，有待進一步增加樣本量，以進一步驗證miR-155-5p、SIRT1的表達情況。其次，對于miR-155-5p調(diào)控EMT過程的信號通路需要進一步探討。

總之, miR-155-5p、EMT相關(guān)標記物在CRSwNP中表達升高，上調(diào)miR-155-5p可通過負性靶向調(diào)控SIRT1促進HNEPC的EMT過程。