駱駝乳蛋白肽抗氧化應(yīng)激研究

文/伍佰鑫 龍 云 羅 陽 孫 鏖 李劍波

（1 湖南省畜牧獸醫(yī)研究所；2 湖南德農(nóng)牧業(yè)集團(tuán)有限公司）

乳蛋白通常是蛋白質(zhì)序列中各種生物活性肽的前體，通過酶作用釋放出來，具有多種功能，如免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗菌和抗癌等。與其他畜乳不同，駱駝乳能治療兒童嚴(yán)重的食物過敏，對(duì)于抗糖尿病、抗中毒、抗病毒、抗菌、抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、抗癌等也具有明顯的效果。機(jī)體氧化應(yīng)激時(shí)，體內(nèi)自由基水平增加，損傷脂類、蛋白質(zhì)和DNA等重要生物分子?；钚匝醮厥茄趸瘧?yīng)激的一個(gè)方面，與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病、炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥等多種疾病有關(guān)。從天然蛋白質(zhì)中提取的一些生物活性肽，對(duì)于抗氧化、抗炎、抗菌和抗高血壓具有顯著作用，且對(duì)人類幾乎沒有副作用。一些研究報(bào)道了駱駝乳的抗氧化作用，但針對(duì)的是發(fā)酵乳、全脂乳、總蛋白水解物或特定蛋白質(zhì)（如乳鐵傳遞蛋白）。關(guān)于駱駝乳蛋白質(zhì)組分或多肽的抗氧化作用，則罕有報(bào)道。為了研究駱駝乳蛋白質(zhì)組分和肽清除自由基、防止氧化應(yīng)激的能力，日本進(jìn)行了相關(guān)研究[1]，對(duì)于國內(nèi)開發(fā)新型治療肽、治療氧化應(yīng)激和相關(guān)疾病、促進(jìn)駱駝乳產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，具有重要的啟發(fā)和參考價(jià)值。

1 研究方法

1.1 蛋白質(zhì)分餾和消化水解

將生鮮駱駝乳在10 ℃、5 000 r/min條件下離心30 min，移除脂肪，上清液通過三層紗布過濾后獲得駱駝乳蛋白（CMP）。一部分CMP凍干保存，其余部分用10%醋酸溶液攪拌均勻至pH值為4.6，30 ℃、5 000 r/min離心10 min。對(duì)于再懸浮顆粒（酪蛋白）和上清液（乳清蛋白），用1000 MWCO（分子量篩截）管進(jìn)行透析、凍干，獲得駱駝酪蛋白（CCP）和駱駝乳清蛋白（CWP）。在鹽酸溶液（pH值為3.0）中，按50∶1（質(zhì)量比）將蛋白質(zhì)與（豬的）胃蛋白酶混合，37 ℃培養(yǎng)2 h后，85 ℃加熱5 min，胃蛋白酶被滅活；室溫下3 000 r/min離心10 min，將上清液pH值調(diào)至7.0，冷凍干燥。通過SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳）還原，分析駱駝酪蛋白（CCP）和駱駝乳清蛋白（CWP）消化液的水解程度；用考馬斯亮藍(lán)（CBB）觀察蛋白質(zhì)條帶；用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）對(duì)水解物進(jìn)行純化，采取C18色譜柱，梯度洗脫，214 nm處監(jiān)控多肽的洗脫情況，收集多肽，真空干燥，使用時(shí)按所需濃度在蒸餾水中重新懸浮。

1.2 抗氧化活性測定

評(píng)定抗氧化活性有兩種方法，即過氧化物清除法和2，2-二苯基-1-吡啶酰肼（DPPH）介導(dǎo)還原試驗(yàn)。前者是通過四唑氮藍(lán)（NBT）為探針的黃嘌呤氧化酶（XOD）將黃嘌呤轉(zhuǎn)化成尿酸，用此過程中產(chǎn)生的過氧化物來評(píng)定過氧化物清除活性，其清除能力用過氧化物還原NBT的程度表示，并在562 nm處測定分光光度值。具體操作步驟如下，100 μL反應(yīng)混合物（包括40 μmol/L NBT、5 mmol/L黃嘌呤、10 mmol/L磷酸鈉緩沖液系列濃度蛋白質(zhì)或多肽，pH值為8.0）置于96 孔培養(yǎng)板中，對(duì)照組不加測試樣；加入100μL XOD（5 mU），在562 nm（37℃）處，通過超高速生物軌跡II微型平板閱讀器（瑞典）監(jiān)測反應(yīng)動(dòng)力學(xué)20 min，減去空白值，結(jié)果用吸光度值的變化表示；每個(gè)樣品有3 個(gè)平行，并重復(fù)測定2次。后者的操作步驟為，在薄層色譜板（5 cm×7.5 cm，德國）涂上6 μL蛋白質(zhì)或多肽，晾干；噴涂含DPPH（1.8 mmol/L）的乙醇溶液；當(dāng)含有清除的DPPH時(shí)，紫色背景會(huì)出現(xiàn)白色斑點(diǎn)。

1.3 氧化應(yīng)激酵母模型

將生長于酵母浸出液蛋白胨葡萄糖（YPD）肉湯培養(yǎng)基中的釀酒酵母（YNN27）細(xì)胞懸浮于肉湯培養(yǎng)基中形成酵母懸浮液，將多肽（200 μg/mL）置于酵母懸浮液中，28 ℃培養(yǎng)1 h；加入2 mmol/L的過氧化氫（H2O2），將培養(yǎng)時(shí)間延長至48 h；在含有2 mmol/L過氧化氫（H2O2）的YPD瓊脂平板上涂10 μL稀釋培養(yǎng)物，28 ℃培養(yǎng)72 h后估算酵母菌落數(shù)，用CFU/mL表示。

1.4 多肽鑒定

將2 μL多肽溶液與2 μL α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-HCCA）基質(zhì)飽和溶液混合到靶板上并風(fēng)干，在1 000～3 200 Da質(zhì)量范圍內(nèi)，采取正反射模式，用自彎曲速度質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，通過對(duì)每個(gè)高峰值的主要前體離子進(jìn)行MS/MS分析，鑒別多肽序列。

2 研究結(jié)果

2.1 駱駝乳蛋白的消化水解

用天冬氨酸蛋白酶（胃蛋白酶）分別水解CMP、CCP和CWP 2 h，凍干前進(jìn)行透析，分析水解物對(duì)SDS-PAGE的還原作用。結(jié)果顯示，CWP與CCP充分分離，所有蛋白質(zhì)（CMP、CCP、CWP）被完全水解成分子量小于8 000 Da的肽；完整的蛋白質(zhì)（CMP、CCP、CWP）顯著減少了藍(lán)二甲醛的形成，表明其具有清除過氧化物的能力，其中CWP清除過氧化物的能力最強(qiáng)，DPPH還原的結(jié)果與清除過氧化物的結(jié)果一致；CCP水解物比其完整蛋白質(zhì)具有更強(qiáng)的清除過氧化物能力，CWP水解物清除過氧化物的能力與其完整蛋白質(zhì)一致；CMP、CWP、CCP的水解物展示了顯著的DPPH還原能力（產(chǎn)生了更強(qiáng)烈的白斑）。因此，它們不僅具有清除過氧化物能力，還具有還原自由基DPPH能力。

2.2 抗氧化肽的分餾

用RP-HPLC法，采取C18色譜柱將CMP、CWP和CCP的多肽分為4 個(gè)亞組分肽，命名為P1～P4。亞組分P1和P2稱為快速洗脫肽（親水），P3和P4則為慢速洗脫肽（疏水）。在濃度為40 μg/mL時(shí)，CMP的所有亞組分肽比其水解物都具有更強(qiáng)的清除活性；無論洗脫時(shí)間長短，CWP的亞組分肽都顯示出最強(qiáng)的清除活性；CMP和CCP的亞組分肽則顯示出從強(qiáng)（P1、P3）到中等（P2、P4）的變化。在各種蛋白質(zhì)中，快速洗脫肽（P1、P2）表現(xiàn)出比慢速洗脫肽更強(qiáng)的DPPH還原能力；CMP和CWP的亞組分肽（P1、P2、P3）表現(xiàn)出比CCP亞組分肽更顯著的DPPH還原能力。因此，快速洗脫肽（親水）是比慢速洗脫肽（疏水）更強(qiáng)的抗氧化劑。

2.3 肽對(duì)酵母細(xì)胞氧化應(yīng)激耐受性的影響

將真核釀酒酵母菌細(xì)胞和駱駝乳多肽共同培養(yǎng)，然后置于含2 mmol/L H2O2的瓊脂板中，觀察細(xì)胞存活情況。與對(duì)照組相比，各種蛋白質(zhì)（CMP、CWP和CCP）亞組分肽的存活率（log CFU/mL）顯著提高；CWP快速洗脫肽的存活率比慢速洗脫肽高，CMP和CCP慢速洗脫肽的存活率更高。胃蛋白酶使CMP釋放出不同的抗氧化肽，其中許多作為胞內(nèi)抗氧化肽起作用，說明某些抗氧化肽具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)能力，從而使活細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激產(chǎn)生耐受性。這些抗氧化肽很有可能會(huì)產(chǎn)生短暫的保護(hù)作用，以抵御隨后的氧化狀態(tài)。

2.4 活性肽序列

CCP水解物在活性高峰值組分（P1、P2、P3）中含有14 個(gè)肽，質(zhì)量范圍為913.12～2 951.68 m/z。CWP水解物在活性高峰值組分（P1、P2）中含有8 個(gè)肽，質(zhì)量范圍為1 168.52～1 861.14 m/z。在酪蛋白中，αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和κ-酪蛋白基本上不會(huì)產(chǎn)生肽，但β-酪蛋白能夠產(chǎn)生許多肽。在乳清中，乳磷蛋白和富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)基本上不會(huì)產(chǎn)生肽，肽主要來自于乳鐵蛋白。

總之，對(duì)駱駝乳蛋白質(zhì)組分進(jìn)行消化水解，可以釋放抗氧化肽。雖然酪蛋白水解物產(chǎn)生了大量具有不同抗氧化能力的肽，但從乳清水解液中提取的肽比酪蛋白具有更高的過氧化物清除能力。酪蛋白肽（特別是高峰值P1中的酪蛋白肽）比乳清中的肽更能有效地降低DPPH還原能力。酪蛋白肽和乳清肽對(duì)H2O2脅迫的酵母細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用。駱駝乳蛋白肽很可能參與了質(zhì)子與自由基的交換，因此具有抗氧化能力。

3 討論

中國是雙駝峰的發(fā)源地和主要產(chǎn)地之一。全國約有駱駝20.5 萬峰左右，主要分布在內(nèi)蒙古、新疆、青海、甘肅、寧夏等省區(qū)約110 萬km2的干旱草原上?！度珖虡I(yè)發(fā)展規(guī)劃（2016-2020）》中鼓勵(lì)發(fā)展特種乳產(chǎn)業(yè)，豐富乳品市場，以滿足人們生活水平日益提高對(duì)多種乳品的需要[2]。

駱駝的胃有三個(gè)胃室，第一室有20～30 個(gè)小氣泡，稱為“水脬”，可在飲水充足時(shí)儲(chǔ)存水分；第二室儲(chǔ)存草料等食物；第三室胃囊具有消化吸收功能。脂肪主要在駝峰聚集，而皮下沒有脂肪。駱駝是所有動(dòng)物中水轉(zhuǎn)換量最低的動(dòng)物，它能調(diào)整結(jié)腸水的吸收量及腎的排泄量，也不需要通過排汗來調(diào)節(jié)體溫。傳統(tǒng)放牧下的駱駝喜歡食用荒漠或半荒漠地區(qū)生長的（多刺）灌木和半灌木，能夠適應(yīng)低蛋白質(zhì)飼料，對(duì)干物質(zhì)、粗纖維及粗蛋白的消化能力比較強(qiáng)[3]。雙峰駱駝（母）的平均泌乳期是14～16 個(gè)月，泌乳期內(nèi)產(chǎn)奶量為1 254 kg。新鮮駱駝乳的pH值為6.5～6.7，含脂肪2.8 7%～5.3 8%、無脂固形物3.70%～10.36%、蛋白質(zhì)3.0%～4.0%、乳糖3.4%～5.8%[4]。駱駝乳粉與雙歧桿菌結(jié)合，可輔助治療糖尿病[5]。

因此，駱駝已經(jīng)進(jìn)入學(xué)者的研究范圍，無論藥用還是食用，駱駝乳均具有開發(fā)潛力。通過加大輿論宣傳和政策扶持，必定會(huì)促進(jìn)駱駝（舍飼）養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。C