大鼠肝癌模型建立的研究進(jìn)展

韋武，郭紅星

(1．天津市血液灌流技術(shù)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市紫波高科技有限公司，天津 300170;2．衛(wèi)生部人工細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，天津市肝膽疾病研究所，天津市第三中心醫(yī)院，天津 300170)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在國(guó)內(nèi)外有著很高的關(guān)注度。作為人類常見惡性腫瘤之一，2015 年的國(guó)內(nèi)癌癥流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示肝癌發(fā)病率位列第4位，病死率位列第3位[1]，為此，對(duì)于肝癌的研究一直是國(guó)家重點(diǎn)支持的項(xiàng)目。肝癌動(dòng)物模型在實(shí)驗(yàn)研究中起著十分重要的作用。因此，構(gòu)建理想的肝癌動(dòng)物模型，往往是決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵因素。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇上，大鼠體型較大、易于飼養(yǎng)、成本低廉、可獲取較大標(biāo)本量，因此是公認(rèn)的研究肝癌的主要?jiǎng)游锬Ｐ椭?。本文?duì)近年來文獻(xiàn)中常用的大鼠肝癌動(dòng)物模型進(jìn)行回顧總結(jié)，并概要介紹建模方法及應(yīng)用。

1 大鼠肝癌模型分類

根據(jù)構(gòu)建模型方法不同，大鼠肝癌模型常見為以下三種：自發(fā)性、誘發(fā)性、移植性肝癌。盡管大鼠是常用的自發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型，但多見于乳腺纖維腺瘤和垂體腺瘤等，鮮有自發(fā)性肝癌報(bào)道，故而仍以誘發(fā)性和移植性兩種應(yīng)用最為廣泛，本文也主要介紹這兩種類型。

2 常用建立模型方法

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠品系

目前，常用于構(gòu)建大鼠肝癌動(dòng)物模型的大鼠品系主要有 SD、Wistar、Fisher344和Buffalo等，其中應(yīng)用最為廣泛的品系為SD和Wistar大鼠[2]。至于胸腺缺陷型的裸鼠，雖然腫瘤易于成活，但由于成本較高，應(yīng)用于構(gòu)建肝癌動(dòng)物模型的報(bào)道并不多見[3-4]。

2.2 誘發(fā)性模型

誘發(fā)性肝癌動(dòng)物模型通常是利用單一或聯(lián)合應(yīng)用多種化學(xué)藥物、生物毒素等直接或間接作用于大鼠肝，使之在數(shù)月內(nèi)發(fā)生肝癌。該方法操作簡(jiǎn)單，癌變率高且易于操控，是構(gòu)建肝癌動(dòng)物模型的理想方法之一。通常采用如下幾種藥(毒)物誘導(dǎo)大鼠肝癌。

2.2.1 用于誘導(dǎo)的化學(xué)物質(zhì)

常用的化學(xué)物質(zhì)如二乙基亞硝胺(N-nitrosodiethylamine， DEN)、3′-甲基-4-二甲基氨基偶氮苯(3′-methyl -4′-dimethylaminoazobenzene，3′-Me-DAB)、2-乙酰氨基芴(2-acetamidofluorene， 2-AAF)、四氯化碳(CCL4)、黃曲霉素(aflatoxin B1,AFB1)等。

2.2.2 給藥途徑

主要分為經(jīng)典飲水給藥法和腹腔注射給藥法兩種，可單獨(dú)使用或聯(lián)合應(yīng)用。其中，飲水法操作簡(jiǎn)單，但因個(gè)體差異會(huì)造成飲水量不同導(dǎo)致攝入藥物差別較大；注射法通常選用腹腔注射途徑，該方法雖可以更準(zhǔn)確地控制注射藥物量，減少個(gè)體差異，但需要多次注射操作，增加了工作量，因而實(shí)驗(yàn)成本較高。

2.2.3 給藥方案

由于可用于誘發(fā)的化學(xué)藥物有多種，且實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，因此，雖然有推薦的方案，但仍可在文獻(xiàn)中見到多種衍生方案。最常見的DEN 給藥方案有，如(1)單獨(dú)采用飲水給藥法誘導(dǎo)，通常按照估算最終攝入劑量為達(dá)到500 mg/kg以上。將DEN投入大鼠飲水中，進(jìn)行3 ～ 6個(gè)月的持續(xù)誘導(dǎo)[5-7]。(2)單獨(dú)采用腹腔注射DEN誘導(dǎo)的方法，近年來有較多文獻(xiàn)報(bào)道[8-11]。通常單次給予DEN劑量為20 ～ 70 mg/kg，每周給藥2 ～ 3次，持續(xù)2 ～ 4個(gè)月。(3)采用腹腔注射藥物后輔以飲水或飼料維持給藥的方式進(jìn)行誘導(dǎo)，方案可采用50 ～ 200 mg/kg DEN單次或多次腹腔注射，其后輔以飲食中攝入DEN或苯巴比妥或2-AAF等進(jìn)行飼養(yǎng)；也有隨后用CCL4腹腔注射維持誘導(dǎo)的方法，均可在數(shù)月內(nèi)誘發(fā)肝癌[12-16]。

再如較常見的2-AFF給藥方案，多為摻入飼料中誘導(dǎo)方式。 趙魯笳等[17]誘導(dǎo)方法為 6% 的3′-Me-DAB 花生油溶液與精制大米按照1:49的比例配置成誘癌飼料，然后按照2次/日，每次5 g進(jìn)行飼養(yǎng)3個(gè)月，3月后改為普通大鼠飼料。 Yan等[18]用濃度為 0.06%的3′-Me-DAB飼料喂養(yǎng)大鼠，20周后誘癌成功。

至于AFB1給藥方案，已經(jīng)不再局限于傳統(tǒng)的口服飼料中大劑量摻雜黃曲霉素的方法，也可采用諸如(1)持續(xù)灌胃法，如Johnson等[19]對(duì)F344大鼠按照每日 200μg / kg的實(shí)驗(yàn)方案持續(xù)灌胃 AFB1 4 周，誘癌成功率高達(dá)96%。(2)低頻次腹腔注射：每周進(jìn)行1～3次腹腔注射，濃度為100 ～ 200 μg/kg，55周左右誘癌成功[20-21]。(3) 高濃度腹腔注射輔以口服飼料誘導(dǎo)：段小嫻等[22]以0.75 ～ 1.5 g/kg的劑量腹腔注射，其后正常飼養(yǎng)，兩周后將飼料換為0.015% 的 2-AAF 飼料，連續(xù)飼養(yǎng)4周，可成功建模。

2.2.4 誘發(fā)周期

除個(gè)案文獻(xiàn)報(bào)道外，多數(shù)藥物誘導(dǎo)方案需要的時(shí)間較長(zhǎng)。通常約為3 ～ 6個(gè)月。

2.2.5 構(gòu)建模型成功率及主要影響因素

除了構(gòu)建與雌激素水平密切相關(guān)的乳腺癌、卵巢癌模型要選擇雌性大鼠外，肝癌建模多選擇對(duì)于化學(xué)誘發(fā)因素更為敏感的雄性大鼠[23]。同時(shí)，選擇幼齡大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型也能夠提高成功率。

2.3 移植性模型

移植性肝癌模型是指將肝癌細(xì)胞株、肝癌組織塊(來源于人或動(dòng)物)或非肝組織來源的惡性腫瘤(如乳腺癌、結(jié)直腸癌等)接種于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝所形成的肝癌動(dòng)物模型。主要包括同種原位移植(腫瘤細(xì)胞類型與宿主動(dòng)物種屬一致)、異種原位移植(如人源肝癌接種到大鼠肝)、異位移植(同種或異種非肝癌細(xì)胞移植于大鼠肝)三種[24]。將肝癌細(xì)胞或者組織直接植入于肝內(nèi)，其在微環(huán)境、形態(tài)學(xué)以及對(duì)后續(xù)治療的反應(yīng)上更加符合肝癌的相關(guān)特征[25]；而異位移植將非肝癌細(xì)胞或者組織塊植入肝，因無法保證提供與腫瘤來源器官相同的微環(huán)境，會(huì)對(duì)異位移植肝癌的發(fā)展產(chǎn)生不利影響[26]。因此，異位模型的治療效果必須通過與原位移植對(duì)比進(jìn)行再次確認(rèn)。目前，多數(shù)學(xué)者通過異位模型確認(rèn)腫瘤生長(zhǎng)情況(如先接種于皮下后再將成長(zhǎng)的組織塊移植到肝)，然后構(gòu)建原位移植模型，以此提高原位移植模型的建模成功率。下面簡(jiǎn)單介紹常見移植性模型的構(gòu)建方法。

2.3.1 經(jīng)皮下種植獲得組織塊后通過手術(shù)移植

此種方法通常選用體外培養(yǎng)擴(kuò)增、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的2 ～ 3代腫瘤細(xì)胞或癌種鼠的腹水癌細(xì)胞懸液進(jìn)行皮下注射，注射點(diǎn)通常為表淺、易于觀察且有充足生長(zhǎng)空間的部位。例如將1×107以上細(xì)胞懸液注射于大鼠皮下，接種10 d左右即可觸摸到瘤塊，此時(shí)即可進(jìn)行手術(shù)切除。將切除的腫瘤塊處理為1 mm3左右的組織塊后，用于肝內(nèi)種植[27]。

2.3.2 開腹進(jìn)行肝內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞

通常采用小切口顯露肝葉，將細(xì)胞懸液注射到肝內(nèi)形成腫瘤[28]。腫瘤細(xì)胞的來源除了體外培養(yǎng)，還可采用癌性腹水離心后收集的細(xì)胞懸液注射的方法[29]，以期獲得更好的種植效果。該方法存在穿刺針孔滲漏導(dǎo)致腹腔播散腫瘤的可能性，但形成的腫瘤定位明確，往往是單一腫塊，便于通過外科切除或者超聲射頻消融治療。

3 構(gòu)建大鼠肝癌模型方法的探索改進(jìn)

3.1 注意操作細(xì)節(jié)以提高成功率

近年來的文獻(xiàn)報(bào)道中，在傳統(tǒng)的飲水或飼料口服給藥誘導(dǎo)方式之外，也出現(xiàn)了較多腹腔注射給藥方式，目的是更為準(zhǔn)確地控制給藥劑量，同時(shí)縮短誘導(dǎo)成瘤的時(shí)間。在構(gòu)建移植性肝癌模型過程中，注重縮短操作時(shí)間以保持植入腫瘤細(xì)胞或組織塊的活性；采用異氟烷、七氟烷等氣體麻醉而不是氯仿、苯巴比妥鈉等腹腔注射麻醉方法；用小切口微型開腹手術(shù)、采用金屬釘快速關(guān)閉手術(shù)切口以減少絲線縫合線的異物刺激等操作細(xì)節(jié)都有益于成功建立模型。

3.2 超聲、MRI引導(dǎo)注射建模

隨著超聲等影像設(shè)備普及，為了盡可能減少有創(chuàng)操作帶來的大鼠創(chuàng)傷應(yīng)激反應(yīng)，借助超聲等進(jìn)行微創(chuàng)注射移植的報(bào)道逐漸增多。引入影像技術(shù)不僅降低了有創(chuàng)操作對(duì)于大鼠免疫系統(tǒng)的影響，而且對(duì)于肝腫瘤的演變過程，可以更為及時(shí)地通過超聲、MRI[30]等進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，獲取影像資料進(jìn)行對(duì)比。

研究表明，大鼠的體液免疫會(huì)形成不利于腫瘤細(xì)胞生存的細(xì)胞因子環(huán)境，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤移植失敗。因此，避免傳統(tǒng)的手術(shù)切開縫合操作對(duì)于大鼠的創(chuàng)傷刺激，弱化不利于移植細(xì)胞生存的局部組織微環(huán)境，一定程度上將提高移植腫瘤的存活率。這種建模方式，需要借助精準(zhǔn)的超聲設(shè)備及專業(yè)技術(shù)人員的嫻熟操作技巧，并未廣泛普及但已經(jīng)在肝癌動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中予以采用。如Buijs等[31]在超聲引導(dǎo)下，將N1-S1細(xì)胞和McA-RH7777兩種細(xì)胞經(jīng)皮穿刺直接接種于SD大鼠肝內(nèi)，一周后超聲可檢測(cè)癌組織存活并生長(zhǎng)。Chu等[32]將N1-S1大鼠肝癌細(xì)胞通過超聲引導(dǎo)植入雄性SD大鼠肝內(nèi)，10 d后檢測(cè)到有腫瘤組織塊。Pan等[33]在超聲引導(dǎo)下，將肝癌細(xì)胞經(jīng)皮注射到大鼠肝葉內(nèi)，并與開腹手術(shù)注射方法相對(duì)比。盡管兩種方法的成瘤率相差不大，但影像學(xué)輔助減小了大鼠創(chuàng)傷反應(yīng)，無疑更有利于研究動(dòng)物負(fù)荷腫瘤情況下的體液免疫變化等。

3.3 免疫抑制措施輔助建立肝癌模型

大鼠的免疫排斥作用是導(dǎo)致構(gòu)建腫瘤模型失敗的因素之一，而采用射線輻照、注射或口服免疫抑制藥物(如環(huán)磷酰胺、糖皮質(zhì)激素、他克莫司、環(huán)孢菌素等)的方法，則可以強(qiáng)化對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的抑制作用，從而提高移植成功率。

4 大鼠肝癌模型應(yīng)用中值得關(guān)注的問題

4.1 選擇化學(xué)藥物誘導(dǎo)模型時(shí)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

DEN誘導(dǎo)法是構(gòu)建大鼠肝癌模型的一種有效方法，其對(duì)肝的誘導(dǎo)作用相對(duì)專一，肝細(xì)胞癌占比較大且誘癌成功率高(約76.67%)[8,34]。DEN誘癌過程中，由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體差異，對(duì)DEN的耐受性不同，存在動(dòng)物死亡或者無腫瘤生長(zhǎng)的情況而導(dǎo)致誘癌成功率的差異。因此，在DEN誘癌實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)考慮到剔除誘導(dǎo)失敗大鼠的樣本數(shù)量。同時(shí)，誘導(dǎo)過程中可密切關(guān)注大鼠狀態(tài)，便于發(fā)現(xiàn)異常及時(shí)調(diào)整誘導(dǎo)方案，不應(yīng)盲目地固定誘導(dǎo)周期，而應(yīng)在動(dòng)物存活前提下提高誘導(dǎo)成功率。

DEN誘發(fā)的肝癌模型，發(fā)病過程較接近人類，病理結(jié)果表現(xiàn)為癌組織呈現(xiàn)彌漫性結(jié)節(jié)，合并肝硬化。在誘癌過程中藥物劑量及給藥途徑易于調(diào)整，多重復(fù)性良好且成功率較高。不足之處為誘發(fā)所需時(shí)間通常需幾個(gè)月甚至更長(zhǎng)。此類模型動(dòng)物的肝功能、免疫狀態(tài)及時(shí)間因素在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)宜予以考慮。

4.2 移植性腫瘤的自發(fā)消除現(xiàn)象

如果不抑制大鼠的免疫系統(tǒng)功能，那么即使將同源的肝癌細(xì)胞接種于健康大鼠皮下或者肝，多數(shù)因受到大鼠自體免疫排異的影響，而出現(xiàn)瘤塊逐漸自行消退現(xiàn)象。因此，如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑槎唐趦?nèi)進(jìn)行手術(shù)切除或者觀察腫瘤演變的動(dòng)態(tài)變化等，選擇移植模型仍有參考價(jià)值。若用于肝癌治療效果的觀察，則必須考慮到大鼠自身免疫排斥作用對(duì)腫瘤的清除作用，而不宜將腫瘤消退或者縮小的效果僅僅歸因于治療作用。

5 結(jié)語

可以說，構(gòu)建大鼠肝癌模型的手段正在不斷增多，傳統(tǒng)的口服及腹腔注射給藥途徑之外、超聲引導(dǎo)穿刺、微創(chuàng)手術(shù)、聯(lián)合免疫抑制等輔助手段也逐漸被研究人員采用。按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適宜方法構(gòu)建高質(zhì)量的大鼠肝癌模型，有助于肝癌研究的學(xué)術(shù)發(fā)展。

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