共培養(yǎng)體系對(duì)哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟影響的研究進(jìn)展

張 俊，石德順，陸鳳花

（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530000）

20 世紀(jì)80 年代后期，為了盡可能模擬體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)的微環(huán)境，人們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上衍生出細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞共培養(yǎng)是指將2 種或2 種以上細(xì)胞共同培養(yǎng)于同一環(huán)境中，包括直接共培養(yǎng)和間接共培養(yǎng)，由于共培養(yǎng)體系與體內(nèi)環(huán)境較吻合，便于細(xì)胞之間相互信息交流溝通，具有相互支撐生長(zhǎng)增殖等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代細(xì)胞培養(yǎng)研究中。哺乳動(dòng)物卵母體外成熟一直是研究卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)、體外受精和胚胎發(fā)育等關(guān)鍵步驟，也一直是研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。與卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟相比，卵母細(xì)胞體外成熟存在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟不協(xié)調(diào)、不同步問題，這直接導(dǎo)致卵子發(fā)育潛力受阻，表現(xiàn)為體外受精胚胎發(fā)育率低和胚胎質(zhì)量差等。哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量差與卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系不完善有密切關(guān)系，因此，致力于卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系的完善，盡可能模擬卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟環(huán)境，一直是研究卵母細(xì)胞體外成熟的重要內(nèi)容。在體內(nèi)卵母細(xì)胞的成熟是與卵泡細(xì)胞共培養(yǎng)的環(huán)境，而細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)具有利用細(xì)胞的代謝產(chǎn)物和促進(jìn)胚胎早期發(fā)育的作用。因此，為了提高哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟的效果，近年來關(guān)于哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟與多種細(xì)胞共培養(yǎng)的研究有諸多報(bào)道。本文主要從卵母細(xì)胞體外成熟與卵泡細(xì)胞共培養(yǎng)、與裸卵共培養(yǎng)和與間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)3 個(gè)方面綜述共培養(yǎng)體系對(duì)哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟的作用，為共培養(yǎng)體系用于大家畜甚至人卵母細(xì)胞體外成熟奠定基礎(chǔ)。

1 卵泡細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)哺乳卵母細(xì)胞體外成熟的影響

卵母細(xì)胞在體內(nèi)成熟時(shí)，外部主要被卵泡細(xì)胞包圍，這些卵泡細(xì)胞包括顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞和卵泡內(nèi)膜細(xì)胞，三者在卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟中不僅具有物理的立體支撐作用，而且能分泌卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟所需要的一些細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如次黃嘌呤、cAMP 等，相關(guān)細(xì)胞因子在維持卵母細(xì)胞成熟阻滯中起到至關(guān)重要作用。因此，為了最大限度模擬卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟的環(huán)境，有關(guān)卵泡細(xì)胞與卵母細(xì)胞成熟共培養(yǎng)的研究越來越多。

目前，卵泡細(xì)胞共培養(yǎng)用于哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟的研究主要集中在綿羊、豬等家畜和人上。Adeldust 等[1]研究了綿羊卵母細(xì)胞體外成熟與顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)可明顯提高綿羊卵母細(xì)胞發(fā)育至MII 期比率和卵裂率。豬卵母細(xì)胞體外成熟時(shí)，適宜細(xì)胞密度的卵丘細(xì)胞與豬卵母細(xì)胞成熟共培養(yǎng)，能提高體外受精（IVF）和孤雌激活（PA）胚胎的發(fā)育潛力，原因是共培養(yǎng)體系可改變卵母細(xì)胞特定基因的表達(dá)，提高細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量，從而提高卵母細(xì)胞體外成熟效率[2]。在豬卵母細(xì)胞冷凍研究中發(fā)現(xiàn)，冷凍復(fù)蘇后未成熟卵母細(xì)胞與豬顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)后能增強(qiáng)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟效果，明顯提高體外受精和卵胞漿單精子顯微注射（ICSI）胚胎發(fā)育能力[3]。也有研究發(fā)現(xiàn)，使用犬卵丘細(xì)胞和輸卵管與豬卵母細(xì)胞成熟共培養(yǎng)，可創(chuàng)造適宜卵母細(xì)胞成熟的微環(huán)境，顯著降低卵母細(xì)胞凋亡水平和細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，增強(qiáng)卵母細(xì)胞成熟效果進(jìn)而提高PA 胚胎發(fā)育潛力[4]。石德順等[5]在牛卵泡內(nèi)膜細(xì)胞的系統(tǒng)研究中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)膜細(xì)胞及其條件液均能提高牛卵母細(xì)胞體外成熟率、受精卵裂率和囊胚率。研究共培養(yǎng)體系提高人卵母細(xì)胞體外成熟效率，這對(duì)臨床輔助生殖技術(shù)具有重要意義。Jahromi 等[6]研究指出，人顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞共培養(yǎng)可顯著提高ISCI 胚胎發(fā)育速度、發(fā)育質(zhì)量和囊胚率，但對(duì)受精率沒有顯著影響。使用同一個(gè)體人成熟卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞與未成熟卵母細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系可在一定程度為卵母細(xì)胞成熟提供卵泡微環(huán)境，進(jìn)而影響胚胎發(fā)育、表觀遺傳和細(xì)胞周期等相關(guān)基因表達(dá)，從而提高卵母細(xì)胞成熟率，甚至可達(dá)到卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟相似水平[7]。截止目前，關(guān)于哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟與卵泡細(xì)胞共培養(yǎng)的研究相對(duì)較多，但大多數(shù)共培養(yǎng)體系集中于顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞，而且都是使用本物種來源細(xì)胞與卵母細(xì)胞成熟共培養(yǎng)。對(duì)于卵泡細(xì)胞共培養(yǎng)影響卵母細(xì)胞體外成熟的具體機(jī)理研究相對(duì)較少，且不夠系統(tǒng)和深入，有待進(jìn)一步研究。

2 裸卵共培養(yǎng)對(duì)哺乳卵母細(xì)胞體外成熟的影響

卵母細(xì)胞成熟時(shí)卵母細(xì)胞和卵泡細(xì)胞之間相互影響，因此，在研究卵泡細(xì)胞共培養(yǎng)旁分泌作用對(duì)卵母細(xì)胞成熟影響同時(shí)，也應(yīng)更關(guān)注卵母細(xì)胞自分泌作用對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響，有關(guān)裸卵共培養(yǎng)的研究主要集中在豬、牛和水牛上。裸卵共培養(yǎng)是指在卵母細(xì)胞體外成熟時(shí)，使用沒有卵丘細(xì)胞包裹的未成熟卵母細(xì)胞與卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體一起培養(yǎng)的方式，研究卵母細(xì)胞自身分泌母源性因子對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的作用。

Morselli 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，家貓裸卵在3D 培養(yǎng)系統(tǒng)與家貓卵母細(xì)胞共培養(yǎng)能提高卵母細(xì)胞減數(shù)分裂能力和后續(xù)胚胎發(fā)育潛力，這可能與裸卵能分泌的一些相關(guān)因子（母源性因子）影響卵母細(xì)胞成熟有關(guān)。豬卵母細(xì)胞體外成熟與裸卵共培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，適宜裸卵與卵母細(xì)胞比例（9:16）共培養(yǎng)可提高豬卵母細(xì)胞成熟卵丘擴(kuò)展和維持減數(shù)分裂阻滯，這可能是卵母細(xì)胞分泌因子和卵母細(xì)胞卵丘細(xì)胞之間縫隙連接所引起[9]。但Appeltant 等[10]研究表明，不論豬裸卵和卵母細(xì)胞比例如何，裸卵共培養(yǎng)不能提高豬卵母細(xì)胞成熟效果、受精率和胚胎發(fā)育。也有研究表明，豬形態(tài)較好卵母細(xì)胞與較差卵母細(xì)胞共培養(yǎng)，可顯著提高形態(tài)較差卵母細(xì)胞成熟效果和胚胎發(fā)育能力，從而提高豬形態(tài)較差卵母細(xì)胞的利用率[11]。牛卵母細(xì)胞成熟與裸卵共培養(yǎng)時(shí)，共培養(yǎng)體系能提高牛體細(xì)胞核移植（SCNT）胚胎發(fā)育能力和胚胎質(zhì)量，基本達(dá)到IVF 胚胎發(fā)育水平[12]。同時(shí)，牛卵母細(xì)胞成熟與裸卵共培養(yǎng)，顯著提高核移植胚胎發(fā)育能力和質(zhì)量，且共培養(yǎng)組胚胎發(fā)育相關(guān)基因甲基化和乙?；脚cIVF 組胚胎相當(dāng)[13]。水牛卵母細(xì)胞成熟與裸卵共培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，水牛裸卵共培養(yǎng)卵母細(xì)胞分泌因子能提高水牛卵丘細(xì)胞凋亡水平和激活細(xì)胞cAMP 產(chǎn)生，但對(duì)類固醇生成沒有影響，這可能是卵母細(xì)胞分泌因子影響卵丘細(xì)胞糖酵解和縫隙連接所致[14]。卵丘細(xì)胞與裸卵共培養(yǎng)可顯著提高裸卵發(fā)育潛力（卵裂率、囊胚率），這可能與二者共培養(yǎng)影響卵母細(xì)胞凋亡、改變細(xì)胞內(nèi)cAMP和MPF 活力以及管控合子基因影響受精率進(jìn)而影響卵母細(xì)胞成熟有關(guān)[15]。目前卵母細(xì)胞成熟與裸卵共培養(yǎng)的研究很少，且在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟時(shí)一般認(rèn)為出現(xiàn)裸卵是由于操作人員技術(shù)所導(dǎo)致，因而忽略了裸卵所起到的作用。上述研究表明，適當(dāng)比例的裸卵與卵母細(xì)胞共培養(yǎng)可促進(jìn)卵母細(xì)胞體外成熟，但是裸卵具體影響卵母細(xì)胞成熟時(shí)卵丘的擴(kuò)展、卵丘與卵母細(xì)胞間縫隙連接還是卵母細(xì)胞本身成熟，目前有待具體進(jìn)行研究。

3 間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)影響哺乳卵母細(xì)胞體外成熟

卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟時(shí)主要被卵泡細(xì)胞包裹，因而上述共培養(yǎng)體系均建立在模擬卵母細(xì)胞成熟的體內(nèi)環(huán)境基礎(chǔ)上，但不止卵泡細(xì)胞共培養(yǎng)能提高卵母細(xì)胞體外成熟效果，其他來源細(xì)胞與卵母細(xì)胞成熟共培養(yǎng)也可提高卵母細(xì)胞體外成熟效率，如間充質(zhì)干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫特性，分泌多種生物活性物質(zhì)如細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子（MCP-1、VEGF-A、EGF、FGF-2、IL-6、LIF和TGFβ等），而有些生物活性物質(zhì)可提高卵母細(xì)胞減數(shù)分裂能力、卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育潛能。Ling 等[16]在小鼠卵母細(xì)胞成熟液中添加小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)BMSC 條件液可促進(jìn)小鼠腔前卵泡發(fā)育，提高卵母細(xì)胞減數(shù)分裂能力、激素產(chǎn)生和皮質(zhì)顆粒分布等，因此，BMSC 共培養(yǎng)明顯提高小鼠腔前卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育潛力。豬卵母細(xì)胞成熟共培養(yǎng)的研究表明，人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSC）與豬卵母成熟共培養(yǎng)，能顯著提高豬卵母細(xì)胞成熟效果和胚胎發(fā)育能力，同時(shí)年輕供者來源ADSC 的共培養(yǎng)成熟效果較年老供者來源ADSC 顯著提高[17]。間充質(zhì)干細(xì)胞在人上的研究相對(duì)很多，目前主要集中于研究間充質(zhì)干細(xì)胞用于細(xì)胞治療、組織工程和器官移植等方面。間充質(zhì)干細(xì)胞用于疤痕修復(fù)和卵巢早衰研究中，也采用間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)的方式利用間充質(zhì)干細(xì)胞可分泌某些生物活性因子從而發(fā)揮作用。但目前使用人間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，用于人卵母細(xì)胞體外成熟的研究尚未見報(bào)道。

4 間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)影響哺乳動(dòng)物腔前卵泡發(fā)育

卵母細(xì)胞成熟與卵泡發(fā)育密切相關(guān)，卵泡發(fā)育是指卵泡由原始卵泡發(fā)育成為初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、三級(jí)卵泡和成熟卵泡的生理過程，在卵泡發(fā)育過程中，卵泡內(nèi)膜細(xì)胞分布有許多血管，參與雌激素的合成。同時(shí)，顆粒細(xì)胞和內(nèi)膜細(xì)胞分泌一些生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等，共同調(diào)控卵泡的發(fā)育。

研究哺乳動(dòng)物腔前卵泡體外培養(yǎng)，可為哺乳動(dòng)物提供更豐富卵母細(xì)胞來源。有研究表明，使用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與人腔前卵泡共培養(yǎng)，可為腔前卵泡提供合適的發(fā)育微環(huán)境，并顯著提高卵泡存活率、生長(zhǎng)速度和生存能力；深入研究發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)體系可顯著上調(diào)卵泡發(fā)育中卵母細(xì)胞GDF9、BMP15表達(dá)，顆粒細(xì)胞inhibitβA、TGFβ1表達(dá)[18]。Rajabi 等[19]研究人月經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞與小鼠腔前卵泡在3D 系統(tǒng)共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系可提高小鼠腔前卵泡生長(zhǎng)成熟和IVF 胚胎發(fā)育潛力，包括卵泡存活率、卵泡腔的形成、雌二醇和孕酮激素水平，同時(shí)上調(diào)GDF9和BMP15表達(dá)，下調(diào)Mater表達(dá)。最新研究表明，小鼠腔前卵泡在3D 系統(tǒng)與小鼠ADSC 共培養(yǎng)，可顯著提高小鼠腔前卵泡存活、生長(zhǎng)發(fā)育和減數(shù)分裂能力，這為研究人自體ADSC 用于人腔前卵泡共培養(yǎng)提供理論依據(jù)[20]。小鼠卵巢內(nèi)皮細(xì)胞與小鼠卵泡發(fā)育共培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn)，被激活卵巢內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)可提高早期卵泡的發(fā)育和存活能力，這為研究早期卵泡發(fā)育成熟以及內(nèi)皮細(xì)胞與卵泡之間聯(lián)系提供良好平臺(tái)[21]。間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)哺乳動(dòng)物腔前卵泡發(fā)育的相關(guān)研究，從卵泡發(fā)育的角度間接說明了共培養(yǎng)體系起到促進(jìn)哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟的作用。

5 展 望

哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的體外成熟一直是制約胚胎工程技術(shù)發(fā)展的難點(diǎn)，也一直是研究的熱點(diǎn)。目前，哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟雖然已經(jīng)進(jìn)行大量系統(tǒng)的研究，但卵母細(xì)胞體外成熟效果與體內(nèi)相比仍然不理想，因此，從細(xì)胞共培養(yǎng)體系的角度出發(fā)，在體外盡可能模擬體內(nèi)卵母細(xì)胞成熟的微環(huán)境，是目前體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞成熟的有效方法，且共培養(yǎng)體系可用同種或異種動(dòng)物細(xì)胞與卵母細(xì)胞共培養(yǎng)，共培養(yǎng)細(xì)胞不止局限于顆粒細(xì)胞、內(nèi)膜細(xì)胞，也包括間充質(zhì)干細(xì)胞等。但目前共培養(yǎng)體系對(duì)哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟作用的具體機(jī)理不清楚，無法在體外對(duì)共培養(yǎng)體系進(jìn)行精細(xì)調(diào)控以進(jìn)一步提高卵母細(xì)胞的體外成熟效率。隨著共培養(yǎng)體系的研究越來越深入和系統(tǒng)，共培養(yǎng)體系的作用機(jī)制越來越明晰，共培養(yǎng)體系提高卵母細(xì)胞體外成熟效率會(huì)更加精準(zhǔn)，共培養(yǎng)體系可廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)，甚至人卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)中。