熒光PCR探針熔解曲線法檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群對利福平和異煙肼耐藥性的價值

吳慧娜 孫付勝 劉清文 戎中錄 張紀東 高陽 李永福 常斐

耐藥結(jié)核病尤其是耐一線抗結(jié)核藥物異煙肼(INH)和(或)利福平(RFP)的結(jié)核病對結(jié)核病控制工作提出了嚴峻挑戰(zhàn)。因此，采用更加快速和準確的檢測方法來檢測結(jié)核分枝桿菌(MTB)的耐藥性，特別是針對RFP和INH的耐藥性檢測，對于患者的有效治療至關(guān)重要。比例法藥物敏感性試驗(DST)是目前檢測一線抗結(jié)核藥物對MTB耐藥性的金標準，主要基于適合MTB生長的羅氏固體培養(yǎng)基(L?wenstein-Jenden，L-J)和BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)基(簡稱“MGIT液體培養(yǎng)基”)接種培養(yǎng)。由于MTB生長緩慢[1]，這些方法耗時較長(MGIT液體培養(yǎng)基耗時約為14 d，L-J羅氏固體培養(yǎng)基耗時約為28 d)，導(dǎo)致患者診斷和治療的延誤，錯過最佳治療時間。

熒光PCR探針熔解曲線法(簡稱“探針熔解曲線法”)耐藥突變檢測是利用多色探針熔解曲線分析技術(shù)針對MTB耐藥基因是否發(fā)生突變所建立的方法。該方法的檢測原理是通過監(jiān)測針對特定耐藥基因設(shè)計的熒光標記探針，在PCR擴增后的熔解分析中是否發(fā)生熔點變化來判斷探針覆蓋區(qū)域是否發(fā)生基因突變。由于可以采用多色熒光標記，可以在一個PCR反應(yīng)中設(shè)計多條探針，達到多重檢測的目的；具有簡便快速、覆蓋位點全面等特點。本研究對臨床分離的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)菌株進行RFP和INH的耐藥性檢測，評價該方法用于實驗室診斷耐藥結(jié)核病的價值。

資料和方法

一、研究對象

2015年1月至2018年7月，由菏澤市各縣(區(qū))結(jié)核病防治所通過中國疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)上報883例肺結(jié)核和耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)患者，并將患者痰標本送至山東省菏澤市傳染病醫(yī)院。所有痰標本按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[2]的操作程序進行處理。收集其中萋-尼染色結(jié)果為陽性的結(jié)核病患者的痰標本共215份(例)進行分離培養(yǎng)，污染5株(例)，培養(yǎng)陰性8株(例)，獲得陽性菌株202株(例)。202株(例)分離培養(yǎng)菌株經(jīng)菌種鑒定有2株(例)為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)，200株(例)為MTBC。

二、研究方法

1. 分離培養(yǎng)：對涂陽痰標本按照文獻[2]的操作方法進行分離培養(yǎng)，培養(yǎng)基為改良羅氏酸性培養(yǎng)基，由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供。

2. 分枝桿菌鑒定及DST：培養(yǎng)陽性產(chǎn)物按照文獻[2]的操作方法進行MTBC鑒定和比例法耐RFP和(或)INH的DST，MTBC鑒定使用對硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基(500 μg/ml)、RFP藥敏培養(yǎng)基(50 μg/ml)和INH藥敏培養(yǎng)基(1 μg/ml)，均由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供。

3. 探針熔解曲線法：經(jīng)鑒定為MTBC的菌株采用探針熔解曲線法(結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測試劑盒和結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥突變檢測試劑盒；均為廈門致善生物科技股份有限公司提供)檢測RFP和INH的耐藥性，實驗操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

4. 質(zhì)量控制：山東省菏澤市傳染病醫(yī)院檢驗科每年培養(yǎng)的污染率均低于5%，DST已通過國家結(jié)核病參比實驗室組織的熟練度測試。探針熔解曲線法操作按照說明書的要求，嚴格進行質(zhì)量控制。

5. 不一致的結(jié)果分析：對于探針熔解曲線法與DST檢測結(jié)果不一致的標本進行測序，引物序列如下：rpoBF(5′-GCGTCGGTCGCTATAAGGT-3′)/R(5′-ACGGGTGCACGTCGCG-3′);katGF(5′-CACACTTTCGGTAAGACCCA-3′)/R(5′-GAA-ACTGTTGTCCCATTCG-3′);mabA-inhAF(5′-CGCTGCCCAGAAAGGGA-3′)/R(5′-TCCTCCGGTAACCAGGACTC-3′);oxyR-ahpCF(5′-ACTGCTGAACCACTGCTTTGC-3′)/R(5′-TGATCG-CCAATGGTTAGCAG-3′)。在ABI 3730自動DNA測序儀上對擴增的DNA產(chǎn)物進行測序，并與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行比較。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

以DST檢測結(jié)果為標準，計算探針熔解曲線法的敏感度、特異度及其95%置信區(qū)間(CI)和符合率；并進行一致性分析(Kappa檢驗)。本研究統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用MedCalc 11.4.2軟件進行計算。Kappa值≥0.60認為兩者有較高的一致性[3]。

結(jié) 果

一、菌種鑒定和DST

200株(例)MTBC分離株DST結(jié)果顯示，110株(例)耐RFP(10株單耐RFP)，144株(例)耐INH(44株單耐INH)。

二、探針熔解曲線法檢測

以DST檢測結(jié)果為標準，探針熔解曲線法檢測RFP耐藥的敏感度、特異度和符合率分別為96.4%(95%CI：90.7%～98.9%)、80.0%(95%CI：70.5%～87.1%)和89.0%；一致性分析結(jié)果顯示，Kappa=0.78(表1)。

以DST檢測結(jié)果為標準，探針熔解曲線法檢測INH耐藥的敏感度、特異度和符合率分別為85.4%(95%CI：78.6%～90.7%)、96.4%(95%CI：87.7%～99.6%)和88.5%；一致性分析結(jié)果顯示，Kappa=0.74(表2)。

三、不一致結(jié)果分析

在對RFP的耐藥性檢測中，200株(例)MTBC分離株中有22株(例)DST和探針熔解曲線法檢測結(jié)果不一致：其中有18株(例)分離株DST檢測結(jié)果為對RFP敏感，但是探針熔解曲線法檢測到耐藥基因突變，測序結(jié)果顯示上述標本在檢測的基因區(qū)域均發(fā)生了突變；另有4株(例)DST檢測為對RFP耐藥，經(jīng)探針熔解曲線法檢測為敏感，測序結(jié)果顯示這4株(例)在檢測的基因區(qū)域均未發(fā)生突變。表型DST和探針熔解曲線法之間的總體符合率為89%(178/200；95%CI：83.5%～92.7%)。

在INH耐藥性檢測中，200株(例)MTBC分離株中的23株DST和探針熔解曲線法檢測結(jié)果不一致。其中2株(例)分離株為DST敏感，但是通過探針熔解曲線法檢測到突變，后續(xù)的基因測序證實了這2株(例)分離株分別在katG315密碼子和ahpC啟動子區(qū)域發(fā)生了突變，而另外21株(例)被DST檢測為INH耐藥的分離株，探針熔解曲線法未檢測到耐藥突變，后續(xù)的基因測序也證實了在試劑盒上述檢測區(qū)域未發(fā)生基因突變(表4)。

討 論

一、分子藥敏試驗檢測方法簡介

近年來，分子藥敏試驗檢測方法由于具有簡便、快速及檢測結(jié)果準確等優(yōu)點，越來越受到臨床的認可。目前有幾種基于核酸擴增的商業(yè)診斷試劑盒。其中GeneXpert?MTB/RIF(美國Cepheid公司)是一種實時半定量PCR檢測方法，直接使用痰樣本來檢測MTB和RFP耐藥性基因突變；INNO-LiPA Rif.TB(比利時Fujirebio公司)和GenoType MTBDRplus(德國Hain Lifescience公司)基于反向印跡雜交探針的線性探針測定，用于快速診斷MDR-TB[5-8]。本研究采用探針熔解曲線法檢測了MTBC對RFP和INH的耐藥性，依據(jù)本研究結(jié)論及臨床操作總結(jié)，筆者認為其具有以下特點：(1)檢測快速、通量高，對臨床分離株培養(yǎng)物樣品檢測可在3 h內(nèi)完成；(2)操作簡便，PCR與熒光探針雜交可在同一反應(yīng)體系內(nèi)實時進行，不需要PCR擴增后的雜交過程；(3)PCR與熒光探針雜交在同一反應(yīng)體系內(nèi)閉管進行，不易造成實驗室樣品間PCR擴增子的交叉污染；(4)檢測結(jié)果陰性、陽性可通過熔解曲線熔點進行判定，結(jié)果分析客觀，易判定。

表1 以DST為標準評價探針熔解曲線法檢測MTBC(200株)對RFP耐藥性的效能

注DST：藥物敏感性試驗；敏感度(%)=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度(%)=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；符合率(%)=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù)+真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；Kappa=(p0-pe)/(1-pe)，p0為實際一致性，pe為理論一致性； 95%CI值的計算方法見參考文獻[4]

表2 以DST為標準評價探針熔解曲線法檢測MTBC(200株)對INH耐藥性的效能

注DST：藥物敏感性試驗；敏感度(%)=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度(%)=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；符合率(%)=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù)+真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；Kappa=(p0-pe)/(1-pe)，p0為實際一致性，pe為理論一致性； 95%CI值的計算方法見參考文獻[4]

表3 基因測序與兩種技術(shù)檢測RFP耐藥性結(jié)果不一致菌株的比較

注S：敏感；R：耐藥

表4 基因測序與兩種技術(shù)檢測INH耐藥性結(jié)果不一致菌株的比較

注S：敏感；R：耐藥

二、探針熔解曲線法檢測RFP耐藥突變基因的評價

MTB 對RFP的耐藥性是由RNA聚合酶的β-亞基突變引起的，RNA聚合酶是rpoB基因編碼的RFP靶標[1]。現(xiàn)有的研究表明，rpoB基因中一段 長81個堿基的核心區(qū)域[編碼507～533位，共27個氨基酸的密碼子；又稱為RFP耐藥決定區(qū)(RRDR)]，當RRDR發(fā)生突變時，使RNA聚合酶β亞單位的結(jié)構(gòu)改變，RFP不能與細菌RNA聚合酶β亞單位結(jié)合，而出現(xiàn)耐藥[9]。超過95%的RFP抗性分離株在rpoB基因的81 bp熱點區(qū)域內(nèi)具有突變[3]，密碼子516、526和531[9]是最常見的突變。本研究采用探針熔解曲線法的RFP耐藥突變檢測試劑，采用4條探針覆蓋了rpoB基因507～533位核苷酸密碼子，能檢測該區(qū)域所有位點的突變。在研究中，大部分RFP抗性分離株在RRDR區(qū)域中具有突變。關(guān)于RFP抗性檢測，探針熔解曲線法顯示出與先前研究相似的敏感度和特異度；對于AnyplexTMⅡ MTB/MDR/XDR測定法(韓國Seegene 公司)敏感度和特異度分別為97%和100%[10]；GenoType MTBDRplus測定法敏感度和特異度分別為93.5%～98%和99%[11-13]；國內(nèi)報道GeneXpert?MTB/RIF分子診斷系統(tǒng)檢測以痰涂片、痰培養(yǎng)為標準的敏感度和特異度分別為93.27%、91.93%和91.60%、95.55%[14]，與DST相比，探針熔解曲線法對RFP耐藥性檢測的特異度僅為80.0%，低于此前的文獻報道[15]。分析可能的影響因素為：首先，推測樣本選擇偏差可能是主要原因。本研究大部分樣本來自已經(jīng)確診為結(jié)核病的患者，甚至一部分已經(jīng)確認為MDR-TB患者，相對較少的真陰性標本可能會導(dǎo)致特異度的波動；其次，由于本研究采用的是羅氏固體培養(yǎng)基，敏感度和特異度均低于相同條件下的MGIT液體培養(yǎng)方法，可能是由于液體培養(yǎng)的前處理液采用的是較低濃度NaOH溶液處理痰標本，以及離心集菌的前處理方法，因而增加了對菌量較少標本的陽性檢出率。故推薦有條件的實驗室行分枝桿菌分離培養(yǎng)時盡可能采用液體培養(yǎng)的方法[16]，以提高陽性率。DST和探針熔解曲線法系統(tǒng)對RFP檢測結(jié)果不一致的18株(例)分離株經(jīng)序列分析證實確實存在突變，特別是部分位點，如rpoB531和526位點，是公認的耐藥突變位點。因此，筆者推測DST結(jié)果可能存在問題，可能是由于技術(shù)錯誤或分析準確性造成的。另外，這18株(例)存在突變的不一致樣本中出現(xiàn)了2株(例)rpoB511位點突變。該位點突變可能與RFP低度耐藥相關(guān)，有研究表明對比例法或絕對濃度法敏感的某些菌株可能已出現(xiàn)RFP低度耐藥，應(yīng)用探針熔解曲線法檢測rpoB基因511位點突變則可以發(fā)現(xiàn)此類菌株，給臨床治療以提示[17]。

三、探針熔解曲線法檢測INH耐藥突變基因的評價

katG315密碼子，inhA啟動子的-15和-8位點及ahpC啟動子區(qū)域的-6～-47位點的突變可覆蓋80%～90%的INH耐藥性菌株。本研究中DST和探針熔解曲線法系統(tǒng)對INH檢測結(jié)果不一致的23株(例)分離株經(jīng)序列分析，有1例突變位點是katG315 AGC-ACC，1例在ahpC啟動子區(qū)域-46位點發(fā)生突變。其余21例分離株經(jīng)探針熔解曲線法系統(tǒng)檢測未發(fā)生突變，經(jīng)測序證實在試劑盒檢測范圍內(nèi)也不存在突變。因此，推測是發(fā)生了檢測范圍外的突變，或者是其他機制所導(dǎo)致的耐藥，尚需要進一步的研究來解決這些患者中未定義的基因和許多潛在的機制。

四、探針熔解曲線法優(yōu)缺點及局限性

筆者推測，由于比例法對DST中接種量進行了校準，它采用了兩種菌液濃度(10-2mg/ml和10-4mg/ml)，通過計算活性單位的比值進行判斷，使結(jié)果更加精準。比例法DST將1%耐藥百分比(耐藥百分比=耐藥培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)/空白培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù))定義為“敏感”和“耐藥”的臨界點[18]，而現(xiàn)在的分子檢測方法，包括Sanger測序法，通常需要20%以上的耐藥型比例才能檢測出。尤其是對于異質(zhì)性耐藥的患者標本(體現(xiàn)細菌群體從部分耐藥向完全耐藥的微小轉(zhuǎn)變過程中的標本)，同時存在敏感菌和耐藥菌；目前有學(xué)者報道，采用高通量測序技術(shù)研究了結(jié)核病患者體內(nèi)MTB異質(zhì)性耐藥的發(fā)展過程，發(fā)現(xiàn)在INH耐藥性產(chǎn)生的早期，同一細菌群體中同時存在4～5 種與INH耐藥相關(guān)的突變，證實了異質(zhì)性耐藥的真實存在[19-20]。這些可能存在的低比例異質(zhì)性耐藥標本有可能導(dǎo)致分子檢測方法的漏檢。另外，在某些情況下，筆者認為應(yīng)對多個平行痰液標本進行DST。Trauner等[21]研究證實，即使在24 h內(nèi)不同時間獲得的3份標本也不均勻，并且可能導(dǎo)致不同的抗性譜，作者進一步認為找到了不恰當?shù)闹委熜纬蒑TBC異質(zhì)性的證據(jù)：通過非最佳治療方案的實施，導(dǎo)致耐藥性克隆的出現(xiàn)。這些克隆可能已經(jīng)存在于宿主MTBC群體內(nèi)不斷產(chǎn)生的遺傳多樣性中。 這種可能性解釋了為什么經(jīng)常會出現(xiàn)對同一藥物具有耐藥性的多克隆在患者體內(nèi)同時產(chǎn)生的情況。筆者的研究也存在一些局限性，由于僅使用MDR-TB的疑似或確診患者的臨床分離株評估探針熔解曲線法，無法將較新或既往治療患者的耐藥率與其他可能的MDR-TB易感原因相關(guān)聯(lián)。因此，有必要進一步研究，從呼吸道樣本直接檢測MTBC耐藥性的影響，并加大樣本量進行驗證研究，同時結(jié)合患者的臨床信息進行分析。

探針熔解曲線法系統(tǒng)允許同時檢測RFP及INH耐藥性相關(guān)突變。該系統(tǒng)是基于熒光PCR和熔解曲線分析方法的組合，在設(shè)備操作和軟件使用方面具有簡單快速的特點。同時，該系統(tǒng)的檢測結(jié)果與常規(guī)表型DST試驗具有高度的一致性。因此，探針熔解曲線法有望成為臨床檢測MDR-TB的有力工具。

志謝濰坊醫(yī)學(xué)院陳景武教授對本文統(tǒng)計學(xué)分析進行了悉心指導(dǎo)！