鮮切獼猴桃片冷藏過程中優(yōu)勢腐敗細(xì)菌的分離鑒定

王虎玄, 代春吉, 孫宏民, 楊 輝

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

獼猴桃，也稱奇異果，是一種風(fēng)味鮮美、品質(zhì)鮮嫩的水果，其口感酸甜可口，營養(yǎng)豐富，同時又具有強(qiáng)化免疫系統(tǒng)，促進(jìn)傷口愈合，降低膽固醇，清熱降火、潤燥通便等保健價值，因而被譽(yù)為“水果之王”，是老少皆宜的滋補(bǔ)果品[1].

獼猴桃原產(chǎn)于湖南省湘西地區(qū)，秦嶺北麓的陜西關(guān)中，如周至、戶縣、眉縣等，已成為中國獼猴桃資源最豐富的地區(qū)之一.近年來，隨著人們生活水平的提高和生活習(xí)慣的改變，鮮切果蔬越來越受到消費(fèi)者青睞[2].由于獼猴桃對人體的營養(yǎng)價值高，其制品在國內(nèi)外市場供不應(yīng)求，尤其是無污染、高品質(zhì)的鮮切獼猴桃片頗受消費(fèi)者歡迎[3,4].

然而，鮮切加工不可避免導(dǎo)致獼猴桃細(xì)胞受損，引起胞內(nèi)汁液(內(nèi)含豐富營養(yǎng)物質(zhì))外滲，從而為外界微生物的污染提供了溫床，極易造成獼猴桃片在冷藏過程中腐爛變質(zhì)，對產(chǎn)品質(zhì)量安全和國內(nèi)外貿(mào)易帶來不利影響，也對獼猴桃加工產(chǎn)業(yè)的快速、健康發(fā)展造成弊端.研究表明，鮮切果蔬在冷藏期內(nèi)的質(zhì)量變化主要與產(chǎn)品褐變和微生物污染有關(guān)，但從整個冷藏期來看，微生物污染引起的腐敗變質(zhì)是主要因素[5,6].因此，對引起鮮切獼猴桃片在冷藏期內(nèi)腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢腐敗菌進(jìn)行分離鑒定具有實(shí)際應(yīng)用價值.

相對一般果蔬制品而言，鮮切果蔬更容易被微生物污染繼而導(dǎo)致變質(zhì)，因而對引起其在冷藏過程中變質(zhì)的相關(guān)腐敗菌進(jìn)行鑒別具有重要意義，可為鮮切果蔬冷藏過程中的微生物腐敗進(jìn)程和機(jī)制提供生物學(xué)證據(jù)，并為該類制品冷鏈流通中的品質(zhì)檢測、質(zhì)量控制以及加工貯藏過程中的減菌和保鮮技術(shù)研究提供指導(dǎo)[6].近年來，關(guān)于鮮切果蔬制品保鮮技術(shù)的研究較多，主要集中于氣調(diào)保鮮、涂膜保鮮、冷殺菌保鮮、生物保鮮技術(shù)等方面[7,8].已有研究人員對引起蘋果、蓮藕、辣椒、生菜等果蔬在鮮切加工、低溫儲存和冷鏈流通過程中變質(zhì)的腐敗菌進(jìn)行了分離鑒定，但有關(guān)鮮切獼猴桃片冷藏過程中優(yōu)勢腐敗菌的分離鑒定仍缺乏系統(tǒng)研究[9-11].

本研究以采購于陜西省周至縣的海沃德獼猴桃(該品種是我國商業(yè)栽培面積最大的主栽品種)為原料，采用細(xì)菌培養(yǎng)基并通過稀釋平板法對冷藏過程中變質(zhì)獼猴桃片樣品中的細(xì)菌進(jìn)行分離純化，觀察單菌落和細(xì)胞形態(tài)，并基于16S rRNA基因測序進(jìn)行菌種鑒定，然后將分離菌株接種于鮮切獼猴桃片，通過感官評定分析獼猴桃片品質(zhì)變化，以驗(yàn)證分離菌株能夠?qū)е芦J猴桃片腐敗變質(zhì)，為獼猴桃片鮮切加工中腐敗細(xì)菌污染的有效控制提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐.

1 材料與方法

1.1 樣品與培養(yǎng)基

1.1.1 樣品

新鮮獼猴桃，可溶性固形物含量為15.3±0.4%，pH值為3.5±0.1，采購于陜西省周至縣.

1.1.2 培養(yǎng)基和主要試劑

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0 g，酵母浸膏2.5 g，葡萄糖1.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL.

營養(yǎng)培養(yǎng)液：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 3.0 g，氯化鈉 5.0 g，蒸餾水 1 L.

生理鹽水：氯化鈉 8.5 g，蒸餾水1 L.

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根)，16S rRNA基因擴(kuò)增引物(北京華大)，PCR試劑(Taq DNA 聚合酶、dNTP、緩沖液、MgCl2)(大連Takara)，Marker(大連Takara)，瓊脂糖(美國Invitrogen).

其它試劑均為國產(chǎn)分析純或生化試劑.

1.2 主要儀器與設(shè)備

JA2003型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、DY-A型電泳儀(上?？颠_(dá)儀器廠)、CX31 型顯微鏡(奧林巴斯公司)、PTC-200型PCR儀(BIO-RAD公司)、HC-3018R型臺式冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)、Gel Doc XR型凝膠成像儀(BIO-RAD公司).

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鮮切獼猴桃樣品的制備

挑選無破損、無病蟲害腐爛的獼猴桃用無菌水洗凈，放于濾紙上瀝干，去皮后再次用無菌水洗滌并用無菌濾紙瀝干.用滅菌的解剖刀將獼猴桃切成均勻的薄片(厚度約為2～3 mm)，準(zhǔn)確稱量20 g，無菌自封袋密封后置于4 ℃下貯存.

1.3.2 可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)的測定

每隔2 d取出冷藏的獼猴桃樣品(3包)，無菌操作下各加入預(yù)先滅菌的生理鹽水180 mL并充分混勻，制成1∶10樣品懸液.取1 mL樣品液用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，參考《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》(GB/T4789.2-2016)中方法進(jìn)行菌落(CFU/g)計(jì)數(shù).

1.3.3 優(yōu)勢腐敗細(xì)菌的分離純化

按1.3.2方法用無菌生理鹽水對已冷藏8 d的獼猴桃片樣品進(jìn)行梯度稀釋，吸取合適稀釋液涂平板，置于30 ℃下培養(yǎng)72 h，每個稀釋度重復(fù)培養(yǎng)3次.選用大直徑(15 cm)平皿以提高分辨率.根據(jù)菌落形態(tài)特征對菌落分組并計(jì)數(shù)，以數(shù)量最多的4～5組菌為優(yōu)勢菌，挑取單菌落進(jìn)行反復(fù)平板劃線純化.純化后的菌落在顯微鏡下觀察純度，不含雜菌后于斜面培養(yǎng)基上劃線接種，36 ℃培養(yǎng)2 d后置于4 ℃保存.

1.3.4 單菌落及細(xì)胞形態(tài)觀察

分離菌株在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線接種，36 ℃培養(yǎng)2～4 d后進(jìn)行單菌落形態(tài)觀察.分離菌株在營養(yǎng)培養(yǎng)液中接種，光學(xué)顯微鏡下(10倍目鏡，100倍物鏡)觀察對數(shù)生長期菌株細(xì)胞形態(tài).

1.3.5 優(yōu)勢腐敗細(xì)菌分子鑒定

各分離菌株在營養(yǎng)培養(yǎng)液中活化后，離心收集菌體.菌體總DNA提取方法參考試劑盒說明書進(jìn)行.

采用通用引物27f:5-AGAGTTTGATC-CTGGCTCAG-3和1492r:5-ACGGCTACC-TTGTTACGACTT-3進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增.擴(kuò)增體系：總體積50μL，包括2μL上游引物，2μL下游引物，25μL Taq PCR MasterMix，2μL模板DNA，19μL 滅菌超純水[10].PCR反應(yīng)程序：95 ℃/3 min(預(yù)變性)；95 ℃/45 s變性，56 ℃/45 s 退火，72 ℃/90 s 延伸，30個循環(huán)；72 ℃/10 min 延伸.擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.0% 瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增是否成功，并委托西安生工技術(shù)有限公司對擴(kuò)增產(chǎn)物序列進(jìn)行測定.通過BLAST工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)對擴(kuò)增產(chǎn)物序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中16S rDNA序列進(jìn)行比對，并通過MEGA 6.0軟件并采用NJ(Neighbour-joining)法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，確定分離菌株遺傳地位[12].

1.3.6 優(yōu)勢腐敗細(xì)菌污染對鮮切獼猴桃品質(zhì)的影響

鮮切獼猴桃片樣品的制備方法基本與1.3.1中的方法一致.不同之處在于獼猴桃切片后用75%的酒精浸泡一定時間，以避免雜菌污染對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾.張開自封袋口于無菌操作臺中放置數(shù)分鐘使酒精充分揮發(fā)，然后接種預(yù)先配制的菌懸液于獼猴桃片表面，混勻后密封，置于4 ℃下冷藏.參考GB/T 22474-2008《果醬》可知色澤、氣味、滋味(考慮到安全性，不做評價)、雜質(zhì)、組織狀態(tài)是評價果片感官質(zhì)量的重要指標(biāo)，挑選8名具有一定感官評定經(jīng)驗(yàn)人員組成評定小組(4男4女，19～32歲)， 對上述指標(biāo)進(jìn)行評價打分.各指標(biāo)評價打分范圍為0～10分，0分表示該指標(biāo)強(qiáng)度偏弱，10分表示該指標(biāo)強(qiáng)度偏強(qiáng).每隔2 d取出冷藏的鮮切獼猴桃樣品進(jìn)行感官評定，記錄評價結(jié)果.計(jì)算各指標(biāo)值的平均值，然后進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 鮮切獼猴桃片冷藏過程中可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)的變化

4 ℃條件下，鮮切獼猴桃片貯存12 d期間的可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)變化規(guī)律如圖1所示.從圖1可以看出，冷藏條件下，獼猴桃片的可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)總體上呈增長趨勢，但在0～6 d，可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)增長相對緩慢，這可能是外界條件變化導(dǎo)致的優(yōu)勝略汰過程：樣品中原有的一部分喜溫菌無法耐受低溫脅迫而死亡，而另一部分細(xì)菌需要調(diào)整新陳代謝途徑以適應(yīng)低溫脅迫.適應(yīng)期過后，耐低溫細(xì)菌通過代謝獼猴桃片營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行增殖，因而冷藏6 d后，可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)呈現(xiàn)出指數(shù)增長的趨勢.第8 d時增加至6.16±0.24 Lg CFU/g；冷藏至第12 d時，菌落總數(shù)已達(dá)到7.42±0.32 Lg CFU/g.一般認(rèn)為，果蔬中總活菌數(shù)達(dá)到6.0 Lg CFU/g左右時就可以認(rèn)為其開始腐敗變質(zhì)，日本最新發(fā)布的微生物管理標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)為新鮮果蔬中活菌數(shù)應(yīng)控制在5.0 Lg CFU/g以下[13].因此，本文中的鮮切獼猴桃片樣品4 ℃貯存8 d后開始腐敗變質(zhì).

圖1 鮮切獼猴桃片4 ℃冷藏過程中可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)的變化

2.2 腐敗細(xì)菌的分離及優(yōu)勢腐敗細(xì)菌的特征

對4 ℃冷藏8 d后的獼猴桃片樣品中的腐敗細(xì)菌進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，可培養(yǎng)細(xì)菌平均菌落總數(shù)為237 CFU/平板；根據(jù)單菌落形態(tài)特征大致分為13組：菌株1～13.其中菌株1～4數(shù)量最多，確定為優(yōu)勢腐敗細(xì)菌.

圖2為菌株1～4的菌落及細(xì)胞形態(tài)特征.由圖2可以看出，占菌落總數(shù)比例最大(30.80%)的菌株1的菌落大小適中，直徑約為1.5～3.0 mm，圓形，白色，表明光滑，邊緣整齊；顯微鏡下觀察為球菌，排列整齊，大小較為一致.其次為菌株2，占菌落總數(shù)的18.14%，其菌落大小一致，圓形，米白色，表面光滑，邊緣整齊，菌落直徑大約為4.0～6.0 mm，菌苔較厚，中間凸起；顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則且大小不一，易成對或排列成短鏈狀.菌株3占菌落總數(shù)的13.08%，其菌苔較薄，菌落大小差異較大(1.5～4.5 mm)，乳白色，表面光滑，邊緣整齊；在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則且大小不一，無規(guī)則排列.菌株4占菌落總數(shù)的8.86%，菌苔較厚，中間凸起，菌落為圓形，黃色，表面光滑，邊緣整齊，大小較為一致，直徑約為3.0～5.0 mm；顯微鏡下觀察為球菌，單獨(dú)或成雙排列.

(a)菌株1的單菌落及細(xì)胞形態(tài)

(b)菌株2的單菌落及細(xì)胞形態(tài)

(c)菌株3的單菌落及細(xì)胞形態(tài)

(d)菌株4的單菌落及細(xì)胞形態(tài)圖2 4株優(yōu)勢腐敗細(xì)菌的單菌落和細(xì)胞形態(tài)

2.3 優(yōu)勢腐敗細(xì)菌的菌種鑒定

由于具有高度的保守性與特異性，16S rDNA已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的分類鑒定研究[14].結(jié)果表明：菌株1與沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)的親緣關(guān)系最近，同源率為99.51%；菌株2與巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)的親緣關(guān)系最近，同源率為99.93%；菌株3和菌株4與葡萄球菌屬菌株(Staphylococcussp.)的親緣關(guān)系最近，同源率分別為99.43%和99.81% ，如表1所示；菌株1、菌株2分別與沃氏葡萄球菌(S.warneri)和巴氏葡萄球菌(S.pasteuri)聚成一類，表現(xiàn)出相同的系統(tǒng)發(fā)育地位；菌株3、菌株4均與葡萄球菌屬菌株(S.sp)具有相同的系統(tǒng)發(fā)育地位，如圖3所示.結(jié)合序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，確定菌株1和2分別為沃氏葡萄球菌(S.warneri)和巴氏葡萄球菌(S.pasteuri)，菌株3和菌株4為葡萄球菌屬菌株(S.sp).菌株3和菌株4通過16S rDNA僅鑒定到屬，后期還需通過其它鑒定技術(shù)如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記、微衛(wèi)星序列測序等確定其種信息.

表1 分離菌株與Genbank參考菌株的比對結(jié)果

圖3 分離菌株16S r DNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

鮮切果蔬作為時尚健康食品越來越受到消費(fèi)者青睞，但由于其在鮮切加工中導(dǎo)致組織細(xì)胞破損，細(xì)胞內(nèi)含物外留(含豐富營養(yǎng)物質(zhì))，在鮮切加工環(huán)境衛(wèi)生條件不達(dá)標(biāo)的情況下，極易引起微生物污染.雖然低溫冷藏可以抑制大部分污染微生物生長，但部分微生物如耐低溫細(xì)菌能夠通過新陳代謝途徑調(diào)控來提高細(xì)胞抵抗低溫脅迫能力，繼而導(dǎo)致鮮切果蔬在低溫貯存中腐敗變質(zhì).目前已在鮮切果蔬中發(fā)現(xiàn)的污染細(xì)菌有李斯特菌、大腸桿菌O157：H7、志賀氏桿菌屬、梭狀芽孢桿菌、醋酸鈣不動桿菌、克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌、耶爾森菌屬等，但本研究分離得到的沃氏葡萄球菌和巴氏葡萄球菌尚未有相關(guān)報道[15].

2.4 優(yōu)勢腐敗細(xì)菌污染對鮮切獼猴桃品質(zhì)的影響

通過回接實(shí)驗(yàn)研究優(yōu)勢腐敗分離菌對獼猴桃片品質(zhì)的影響，以驗(yàn)證四株分離菌腐敗性.圖4展示了冷藏條件下，接種獼猴桃片各感官評價指標(biāo)值隨冷藏時間延長的變化.從圖4可以看出，四株分離菌污染對鮮切獼猴桃品質(zhì)的影響基本一致，接菌后獼猴桃片果香較濃，沒有發(fā)黃、腐臭、變軟、液化等不良品質(zhì)變化；冷藏2 d 后，獼猴桃片果香衰減，出現(xiàn)輕微發(fā)黃、腐臭、變軟、褐變等不良變化；冷藏4 d后，獼猴桃片果香持續(xù)衰減，果籽附近顏色變深有輕微發(fā)黑，腐臭味加重，獼猴桃片軟化加重，自封袋內(nèi)出現(xiàn)液體水分；冷藏6 d后，樣品果香味微弱，腐臭味持續(xù)加重，甚至刺鼻，果籽附近顏色發(fā)黑加重，自封袋內(nèi)出現(xiàn)大量液體水分，并且液體較為渾濁；冷藏8～10 d后，樣品果香味完全消失，散發(fā)刺鼻腐臭味，獼猴桃片發(fā)黃并軟化嚴(yán)重，自封袋底部出現(xiàn)大量渾濁水分，已完全腐敗變質(zhì).

(a)4 ℃冷藏下菌株1污染對獼猴桃片品質(zhì)的影響

(b)4 ℃冷藏下菌株2污染對獼猴桃片品質(zhì)的影響

(c)4 ℃冷藏下菌株3污染對獼猴桃片品質(zhì)的影響

(d)4 ℃冷藏下菌株4污染對獼猴桃片品質(zhì)的影響圖4 分離菌株污染對獼猴桃片品質(zhì)的影響

鮮切加工破壞了獼猴桃果實(shí)屏障，使果肉組織直接與外界環(huán)境接觸，外界的一些不利因素如氧氣、微生物污染等導(dǎo)致裸露組織發(fā)生變色(主要為褐變)、果實(shí)固有風(fēng)味及果實(shí)營養(yǎng)損失、果片硬度降低等一系列影響果片品質(zhì)的生理生化反應(yīng).獼猴桃鮮切加工中發(fā)生的褐變主要為酶促褐變，多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是催化該反應(yīng)的關(guān)鍵酶，果實(shí)中的酚類化合物在PPO的催化下與環(huán)境中氧氣發(fā)生一系列反應(yīng)，生成的醌類產(chǎn)物進(jìn)一步發(fā)生聚合反應(yīng)后形成黑色產(chǎn)物，導(dǎo)致果片顏色加深.已有報道指出在提前使用保鮮劑處理樣品的條件下，果蔬在鮮切加工后也會發(fā)生褐變，并且隨著儲存時間的延長其褐變程度會逐漸加重[16].鮮切加工后，獼猴桃果實(shí)固有風(fēng)味的損失主要是由于果實(shí)天然屏障(果皮)的去除以及冷藏過程中腐敗菌新陳代謝活動，產(chǎn)生三甲胺、乙酸、硫化氫、乙硫醇等腐敗臭味，導(dǎo)致鮮切獼猴桃原有果香味的衰減及腐臭味的加重[15].果片硬度降低主要是因?yàn)楣M織細(xì)胞壁在來源于腐敗細(xì)菌代謝產(chǎn)生的胞壁降解酶作用下發(fā)生了降解，同時果肉組織細(xì)胞間質(zhì)中的原果膠(不溶于水)發(fā)生水解反應(yīng)，生成果膠(溶于水)，導(dǎo)致細(xì)胞間質(zhì)軟化，細(xì)胞相互分離，宏觀上表現(xiàn)為果肉組織硬度降低；此外，失水和滲透性的改變是影響鮮切獼猴桃片硬度的另一個主要原因.鮮切果蔬的最大優(yōu)勢在于營養(yǎng)、美味、便捷，但因?yàn)轷r切加工損傷果肉組織細(xì)胞，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)豐富的細(xì)胞內(nèi)容物外流，繼而引發(fā)冷藏期間腐敗微生物污染鮮切果蔬導(dǎo)致果肉組織細(xì)胞內(nèi)發(fā)生系列生理生化反應(yīng)，降低其營養(yǎng)價值.有報道指出鮮切蘋果片有關(guān)營養(yǎng)價值的理化指標(biāo)如總糖、可溶性固形物含量、Vc含量、可滴定酸含量等隨著冷藏時間的延長逐漸降低[17].目前，為了供應(yīng)高品質(zhì)的新鮮產(chǎn)品，在鮮切果蔬產(chǎn)業(yè)中已廣泛開展了殺菌防控技術(shù)研究，包括傳統(tǒng)氯殺菌技術(shù)以及輻照殺菌、紫外先殺菌、等離子體殺菌、脈沖電場殺菌等代替氯的其他冷殺菌技術(shù)，為鮮切果蔬加工中腐敗菌污染的控制提供了技術(shù)保障.

3 結(jié)論

鮮切果蔬冷藏期間其表面腐敗細(xì)菌的種類及數(shù)量直接影響產(chǎn)品品質(zhì)及貨架期.本文結(jié)果表明，鮮切獼猴桃片在4 ℃冷藏過程中，可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)隨著冷藏時間延長逐漸增加，冷藏第8 d時達(dá)到6.16±0.24 Lg CFU/g，進(jìn)入腐敗初期，此后可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)以指數(shù)形式增加，腐敗加?。焕洳剡^程中的優(yōu)勢腐敗細(xì)菌主要為沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)和葡萄球菌屬(Staphylococcussp.)菌株；回接實(shí)驗(yàn)表明分離純化的四株優(yōu)勢菌株均對鮮切獼猴桃片有腐敗作用.上述結(jié)果為鮮切獼猴桃片冷藏過程中的腐敗細(xì)菌污染進(jìn)程和機(jī)制提供了生物學(xué)證據(jù)，上述腐敗細(xì)菌也可成為鮮切獼猴桃片產(chǎn)品質(zhì)量安全系統(tǒng)評價的潛在指標(biāo).