大鼠脊髓突觸體中生理活性物質(zhì)分析①

劉正，袁文華，趙舒煊，沈偉，馮曉飛，周海宇

1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，甘肅蘭州市730030；2.甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州市730030

突觸是神經(jīng)元相互接觸的部位，是神經(jīng)元之間在功能上發(fā)生聯(lián)系的部位，也是信息傳遞的關(guān)鍵部位。突觸體最早由Whittaker等命名[1]，是指具有突觸區(qū)完整形態(tài)結(jié)構(gòu)的封閉顆粒[2]，某種意義上可被認(rèn)為是具有功能完整的活細(xì)胞[3]，但與細(xì)胞又有很大區(qū)別。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)典型突觸前神經(jīng)末梢具有100~200個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)填充的突觸小泡，在動(dòng)作電位刺激下以Ca2+依賴性方式將其內(nèi)容物釋放到突觸間隙中[4]。本研究對(duì)大鼠脊髓突觸體中生理活性物質(zhì)進(jìn)行分析測(cè)定，為探究相關(guān)疾病的機(jī)制提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性Sprague-Dawley大鼠，標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量，由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXY(甘)2009-0004，使用許可證號(hào)SYXK(甘)2009-0005。

1.2 主要儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀、ZORBAX Eclipse-AAA色譜柱(4.6×150 mm,5 μm)：美國(guó)AGILENTTECHNOLOGIES公司。BP1215分析天平：德國(guó)SARTORIUS公司。Heal Force NW超純水機(jī)系統(tǒng)：上海力新儀器有限公司。3K15、3-30k離心機(jī)：北京五洲東方科技發(fā)展有限公司。U-3900H紫外分光光度計(jì)、U-3900H熒光分光光度計(jì)：日本日立公司。

1.3 主要試劑及其配制

Percoll分層液：美國(guó)GE HEALTHCARE公司。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、10×PBS(NaCl 40.0 g、KCl 1.0 g、KH2PO41.0 g、Na2HPO4·12H2O 10.4 g)、TritonX-100、乙二醇-雙-(2-氨基乙基)四乙酸EGTA：北京索萊寶科技有限公司，純度≥99%。OPA衍生劑、硼酸鹽緩沖液：美國(guó)AGILENTTECHNOLOGIES公司。甲醇、乙腈(色譜純)：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。Na2HPO4·10H2O(優(yōu)級(jí)純)、蔗糖緩沖液(0.32 mol/L蔗糖、1 mmol/L EDTA、5 mmol/L Tris，pH=7.4)、人工腦脊液：上海源葉生物科技有限公司。戊二醛：上海生工生物有限公司。超微量ATP酶測(cè)試盒(Na+-K+、Ca2+-Mg2+、總ATP酶)、ATP測(cè)試盒：南京建成生物工程研究所。Ca2+熒光探針Fluo-3AM(5 mM)：上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

流動(dòng)相A：Na2HPO4·10H2O 14.32 g加水1 L，鹽酸調(diào)pH=7.8。流動(dòng)相B：乙腈∶甲醇∶水=45∶45∶10(體積比)。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品配制：分析天平準(zhǔn)確量取一定質(zhì)量氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，溶于超純水中配制1 nmol/L氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，4℃保存，使用時(shí)稀釋至不同濃度。

1.4 樣品提取

雌性Sprague-Dawley大鼠斷頭處死，冰袋上迅速取出頸髓至腰髓全部脊髓組織，4℃蔗糖緩沖液中洗滌2~3次，盡可能剝除脊髓膜；用預(yù)冷的濾紙吸干表面水分，稱重后放入預(yù)冷的玻璃勻漿管中，按質(zhì)量體積比1∶10加入蔗糖緩沖液，勻漿6~10次。勻漿液3600 r/min 4℃離心10 min，取上清液；上清液2 ml平鋪于3%Percoll蔗糖梯度層，20,000 r/min 4℃離心5 min，取第三、四層分界處懸液。懸液1∶5(體積比)加入蔗糖緩沖液稀釋，置10 ml離心管中，15,000 r/min離心20 min，沉淀即為脊髓突觸體。置預(yù)先持續(xù)通以 O2、CO2(體積比 95∶5)30 min，并在 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃預(yù)培養(yǎng)30 min的適量人工腦脊液中，混勻。

1.5 氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)測(cè)定

人工腦脊液中脊髓突觸體分成3份，置24孔板的3個(gè)孔中，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)15 min。

第1份加適量人工腦脊液后，超聲細(xì)胞破碎儀破碎(超聲破碎組)，工作參數(shù)：50 W，工作5 s，暫停10 s，共15次。破碎時(shí)試管應(yīng)完全浸入冰水浴，防止高溫造成突觸體碳化。破碎后，12,000 r/min 4℃離心20 min，取上清液-70℃保存。

第2份加等體積終濃度50 mmol/ml KCl溶液(KCl刺激組)，繼續(xù)反應(yīng)30 min，迅速置于冰水浴中，12,000 r/min 4℃離心20 min，取上清液于-70℃保存。

第3份加入等體積人工腦脊液，其余處理同第2份(正常溫育組)。

高效液相色譜儀測(cè)定3份上清液中谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、GABA的含量。上樣前平衡色譜柱，待柱溫箱溫度適宜，色譜波穩(wěn)定后上樣。

1.6 ATP和ATP酶測(cè)定

脊髓突觸體混懸液15,000 r/min離心10 min，取下層沉淀，加入熱雙蒸水500μl，100℃熱水浴破碎；懸液于沸水浴中加熱10 min，混勻抽提1 min。所得樣本用于ATP含量測(cè)定。

取適量脊髓突觸體混懸液離心后取下層沉淀，加生理鹽水500μl混勻，超聲細(xì)胞破碎儀破碎。所得樣本用于ATP酶活性測(cè)定。

紫外分光光度計(jì)，測(cè)定波長(zhǎng)636 nm，光徑1 cm，雙蒸水調(diào)零。

1.7 Ca2+測(cè)定

用人工腦脊液(純氧負(fù)載1 h)將混勻的脊髓突觸體平均分成2份，置24孔板2個(gè)孔中，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)15 min。一份加終濃度50 mmol/L KCl(KCl處理組)，另一份加等量生理鹽水(生理鹽水組)，然后兩份各加入等量0.25 mmol/L Fluo-3AM，使終濃度為0.5μmol/L，繼續(xù)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光溫育30 min。熒光探針裝載，15,000 r/min離心10 min，共2次。去上清液，加等量人工腦脊液重懸。熒光分光光度計(jì)檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)506 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm，測(cè)定吸光度值F；加入4%TritonX-100，使終濃度為0.1%，避光混勻10 min，測(cè)定最大吸光度值Fmax；加入EGTA使終濃度為5 mmol/L，避光混勻10 min，測(cè)定最小吸光度值Fmin。計(jì)算細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度([Ca2+]i)[5]：

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以(xˉ±s)表示，多組間比較采用方差分析。標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度采用線性回歸分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果

2.1 氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)

各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋至10 pmol/ml，高效液相色譜儀色譜圖見(jiàn)圖1。

大鼠脊髓突觸體懸液用高效液相色譜儀檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。在8.7 min左右分離出一個(gè)色譜峰⑤，排除相近氨基酸后，無(wú)對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)。

根據(jù)樣本所得峰面積計(jì)算樣本氨基酸濃度，再根據(jù)樣本的蛋白濃度(1.873 g/ml)轉(zhuǎn)化為pmol/mg蛋白質(zhì)。與正常溫育組相比，KCl刺激組天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、GABA增加(P<0.05)。超聲破碎組由于含量低于氨基酸標(biāo)樣范圍(4.5~450 pmol/ml)，數(shù)據(jù)未參與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。見(jiàn)表1。

樣本試樣后，估計(jì)氨基酸遞質(zhì)濃度，配制10 pmol/ml、 15 pmol/ml、 20 pmol/ml、 25 pmol/ml、 50 pmol/ml氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，得到不同濃度氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)峰面積，建立線性公式。見(jiàn)表2。

圖1 混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖

圖2 樣品的色譜圖

表1 各組氨基酸含量(pmol/mg)

表2 各氨基酸濃度線性公式及檢驗(yàn)

2.2 ATP酶活性和ATP含量

ATP酶活性測(cè)定樣本蛋白濃度為1.099 g/L，ATP含量測(cè)定樣本蛋白濃度為1.648 g/L，標(biāo)準(zhǔn)品線性公式為Y=0.9407x+0.0938(R2=0.99)。ATP酶活性測(cè)定和結(jié)果見(jiàn)表3。Na+-K+-ATP酶活性高于Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。

ATP含量(414.7461±3.8562)μmol/mg(n=3)。

表3 ATP酶活性結(jié)果

2.3 [Ca2+]i測(cè)定

熒光分光光度計(jì)檢測(cè)熒光光譜見(jiàn)圖3。樣本蛋白濃度為1.20 g/ml。各組Ca2+濃度見(jiàn)表4。

圖3 樣品熒光光譜

表4 各組[Ca2+]i測(cè)量結(jié)果

3 討論

本研究在大鼠脊髓突觸體中氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)測(cè)定中，發(fā)現(xiàn)在8.7 min左右分離出一個(gè)色譜峰，該峰較高，峰面積大，但由于沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照(已排除相近氨基酸)，未進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)OPA衍生試劑衍生氨基酸的原理，推測(cè)這是一種含有氨基端的物質(zhì)。

ATP作為生命活動(dòng)能量的直接來(lái)源，可以為突觸體釋放或傳遞氨基酸遞質(zhì)等短暫生理活動(dòng)，以及維持完整的膜結(jié)構(gòu)提供能量。組織有炎癥、損傷時(shí)，損傷周圍會(huì)釋放大量ATP[6-7]，脊髓組織同樣存在這一現(xiàn)象[8-9]。劉磊等[10]證實(shí)，脊髓缺血再灌注損傷時(shí)，ATP酶活性下降；陸新穎等[11]發(fā)現(xiàn)，脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元Na+-K+-ATP酶活性會(huì)在骨骼肌損傷后現(xiàn)迅速下降，后逐漸恢復(fù)。Na+-K+-ATP酶主要負(fù)責(zé)神經(jīng)系統(tǒng)Na+和K+的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，以及神經(jīng)元興奮性所需電化學(xué)梯度的維持和重建[12]。此外，Na+-K+-ATP酶還可能在神經(jīng)元和突觸可塑性中起重要作用，酶活性降低與許多行為異常有關(guān)，包括運(yùn)動(dòng)改變[13]。

突觸前膜對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放有Ca2+依賴性量子式囊泡釋放和Ca2+非依賴非囊泡釋放[14]。生理?xiàng)l件下，哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要氨基酸遞質(zhì)谷氨酸和GABA主要依靠Ca2+依賴性釋放[15]；神經(jīng)系統(tǒng)受損時(shí)，神經(jīng)元缺血缺氧，ATP缺乏，細(xì)胞外K+濃度升高，興奮性氨基酸遞質(zhì)釋放增加，引起相應(yīng)受體門控離子通道開(kāi)放，Ca2+內(nèi)流入細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)Ca2+大量增加，造成遲發(fā)性神經(jīng)元損害[16]。Ca2+超載是神經(jīng)系統(tǒng)缺血時(shí)神經(jīng)元死亡的主要原因[17]。

突觸體相關(guān)實(shí)驗(yàn)有助于鑒定神經(jīng)遞質(zhì)，典型的方法包括檢測(cè)放射性標(biāo)記的神經(jīng)遞質(zhì)誘發(fā)釋放，包括GABA、谷氨酸、乙酰膽堿等；或通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)內(nèi)源性釋放。后來(lái)通過(guò)熒光酶聯(lián)免疫法實(shí)時(shí)檢測(cè)內(nèi)源性胞吐作用，并通過(guò)熒光苯乙烯基染料的攝取實(shí)時(shí)檢測(cè)突觸囊泡內(nèi)吞作用[18]。隨著用于操縱離子通道和受體的藥理學(xué)工具出現(xiàn)，關(guān)于突觸體的大量實(shí)驗(yàn)有助于確定調(diào)節(jié)神經(jīng)傳遞的主要調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)途徑。

突觸在許多神經(jīng)障礙的發(fā)病機(jī)制和病理學(xué)中起著重要作用。近年來(lái)，敲除或敲入基因小鼠制備的突觸體已被用于支持突觸蛋白作用的研究[19-20]。突觸體和突觸小泡制劑也經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析[21]。蛋白質(zhì)組學(xué)研究編制了神經(jīng)元特異性蛋白質(zhì)在突觸中的運(yùn)作，強(qiáng)調(diào)這些蛋白質(zhì)經(jīng)歷大量翻譯后修飾，以響應(yīng)突觸活動(dòng)而發(fā)生變化[22]。

本研究建立了脊髓突觸體內(nèi)物質(zhì)的檢測(cè)方法，可用來(lái)研究相關(guān)致病因素與脊髓疾病的關(guān)系。脊髓突觸體模型可以研究脊髓神經(jīng)元變性的機(jī)制，從而找到臨床干預(yù)點(diǎn)，探討更加合理的治療方式。利用藥物作用于脊髓突觸體，可探討藥物對(duì)脊髓突觸體的作用，對(duì)于驗(yàn)證臨床用藥的合理性以及開(kāi)發(fā)新藥都有重大意義。