熒光免疫分析法在牛奶抗生素殘留檢測中的研究進展

阿說阿沙 ， 鄒文佳 ， 付婧潔 ， 楊騰昆 ， 余林霖 ， 楊 柳 ， 江海洋

(1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.北京維德維康生物技術(shù)有限公司 ， 北京 海淀 100095)

1 牛奶中抗生素的檢測現(xiàn)狀

為保障食用牛奶的安全，加強對牛奶中抗生素殘留檢測十分必要。液相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜等儀器檢測方法，可以準確地測定出牛奶中抗生素的具體殘留量，但操作步驟繁瑣，儀器設備要求嚴格，再加之鮮牛奶保質(zhì)期限的短暫性，儀器檢測法顯然不適用于基層大批量現(xiàn)場檢測。而快速檢測技術(shù)由于操作簡便快捷，已成為奶牛養(yǎng)殖企業(yè)和乳品生產(chǎn)加工企業(yè)日常監(jiān)管的重要手段，其中熒光免疫分析技術(shù)因其靈敏度高、特異性好等優(yōu)點正逐步成為發(fā)展的主流方向。

熒光免疫分析方法是目前被廣泛應用的快速檢測方法之一，是將熒光材料的靈敏光學性質(zhì)與免疫原理有機結(jié)合，從而實現(xiàn)微量殘留檢測的一種快速檢測方法。相比于其他的檢測方法，熒光免疫分析方法具有操作簡單快捷、可視化程度高、靈敏度較高、特異性強等優(yōu)勢，是快速檢測牛奶中抗生素殘留的良好手段。文章在查閱文獻的基礎上，總結(jié)概括了時間分辨熒光免疫分析、量子點熒光免疫分析、熒光偏振免疫分析、熒光猝滅免疫分析與熒光增強免疫分析等5種常用熒光免疫分析技術(shù)在牛奶抗生素殘留檢測中的研究進展及其優(yōu)勢與劣勢。

2 時間分辨熒光免疫分析(Time-Resolved Fluorescence，TRFIA)

時間分辨熒光免疫分析法是以鑭系元素作為標記物，結(jié)合抗原抗體的特異性反應，從而實現(xiàn)待測抗原或抗體的檢測目的，其熒光壽命長達100-1 000 μs，較本底熒光(1-10 ns)長，可通過延長檢測時間以消除生物材料中的背景干擾，同時時間分辨熒光具有較寬的Stokes位移[1]，有利于區(qū)分與測量，因此與傳統(tǒng)熒光免疫分析法相比，TRFIA的靈敏度和準確度得以大大提高，同時具有操作迅速簡便、無放射性污染、特異性良好等優(yōu)點[2]，使得TRFIA在獸藥殘留檢測領域不斷得到重視與發(fā)展。

目前，許多抗生素都已成功建立時間分辨熒光免疫分析法進行其殘留檢測，包括氟喹諾酮類[3]、氯霉素[4]、鏈霉素[5]等，為了更好地滿足檢測市場的發(fā)展需求，基于TRFIA的高通量[6]、定量檢測與更高靈敏度的檢測方法正在不斷得到發(fā)展與突破。Bacigalupoa M A等[7]建立的時間分辨免疫方法，以Eu3+(鈾)作為標記物，實現(xiàn)了定量檢測牛奶中氨芐青霉素的殘留，特異性較好，靈敏度達1 ng/mL，比歐盟規(guī)定的限制靈敏度高達4倍，且由于樣品不需要進行前處理，檢測時間得以縮短，經(jīng)儀器法確證，可用于大批量的現(xiàn)場快速檢測。

因TRFIA較傳統(tǒng)檢測方法具有諸多優(yōu)勢，不少企業(yè)開始將目光投向基于TRFIA的快速檢測產(chǎn)品開發(fā)中來。但所需原料物質(zhì)價格較昂貴，檢測成本高，從而限制了其進一步的市場發(fā)展空間，因此探索一種具有時間分辨熒光性質(zhì)且價格低廉的標記物質(zhì)對推進TRFIA的商業(yè)化應用是具有重大意義的。

3 量子點熒光免疫分析(Quantum dot fluorescence immunoassay)

量子點(Quantum dot)是一種特殊的納米級半導體材料，是一種新興的熒光探針。不同顆粒大小的量子點在光的激發(fā)下，可以產(chǎn)生不同顏色的光。目前，量子點技術(shù)被廣泛應用在電視機制造行業(yè)，由于其發(fā)光強度和靈敏度較高，是一種良好的熒光標記探針，因此在生物醫(yī)學以及環(huán)境檢測等領域也有較高的應用價值[8]。近年來，量子點在免疫層析試紙技術(shù)等檢測領域的應用報道也越來越多，應用范圍涉及中東呼吸綜合征冠狀病毒[9]、農(nóng)藥殘留[10]以及抗生素殘留檢測等方面。

量子點免疫層析技術(shù)比傳統(tǒng)膠體金免疫層析技術(shù)等具有更高的靈敏度，可同時檢測多種抗生素殘留，方法穩(wěn)定性較好。Taranova N A等[11]建立的多色量子點免疫層析法，可同時檢測牛奶中氧氟沙星、氯霉素和鏈霉素的殘留，檢測限分別為0.3 ng/mL、0.12 ng/mL、0.2 ng/mL，比傳統(tǒng)ELISA方法靈敏80～200倍，且檢測過程只需10 min。Song E等[12]建立了同時檢測牛奶中鏈霉素、四環(huán)素和青霉素的量子點熒光免疫方法，線性范圍分別為0.01～25 ng/mL、0.01～25 ng/mL和0.01～10 ng/mL。

然而，量子點因含有有毒重金屬離子而對生物體有一定危害性，而且為了取得進一步的發(fā)展與突破，量子點熒光免疫分析方法中抗體-熒光標記物的穩(wěn)定性仍需進一步加強，需要研究更加簡易且穩(wěn)固的探針連接方式[13]，研發(fā)抗干擾試劑，從而進一步降低假陽性率，實現(xiàn)更高的靈敏度。[14]

4 熒光偏振免疫分析法(Fluorescence polarization immunoassay)

熒光偏振免疫分析是基于熒光偏振原理和競爭免疫反應基礎的一種定量分析技術(shù)。由于偏振光的強弱程度與熒光分子大小與激發(fā)時的轉(zhuǎn)動速度的相關性，熒光偏振免疫分析技術(shù)更適合應用于藥物、激素等中小分子的檢測[15]。Xuan-Anh Ton等[16]利用基于分子印跡聚合物的熒光偏振測量方法實現(xiàn)了對牛奶中恩諾沙星和達氟沙星的定量檢測，檢測限分別為0. 28 μmol/L和0.08 μmol/L，相比于膠體金免疫層析方法，熒光偏振免疫分析法的檢測靈敏度更高。同時，相比于傳統(tǒng)ELISA法，熒光偏振免疫分析方法省略了洗滌過程，操作簡便快捷，可實現(xiàn)高通量檢測，可以更好地滿足快速檢測需求。此外，由于該法檢測的是熒光偏振值，因此不受樣品本身顏色及儀器條件的影響，有效提高了方法的靈敏度和穩(wěn)定性[17]。

盡管熒光偏振免疫分析法的檢測過程中前處理和操作步驟相對較簡單，且反應時間短，有利于大量樣品的檢測分析，但在靈敏度和新方法的建立上，還有很大的發(fā)展空間[18]。

5 熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)

5.1 熒光猝滅免疫分析(Fluorescence quenching immunoassay，F(xiàn)QIA) 基于熒光物質(zhì)發(fā)生猝滅后熒光信號強度減弱的程度來檢測待測物質(zhì)含量的免疫分析方法稱熒光猝滅免疫分析(FQIA)，如重金屬離子、鹵素離子、硝基化合物、羧基化合物等能引起熒光猝滅效應的物質(zhì)稱為熒光猝滅劑[19]。

目前，F(xiàn)QIA正不斷與其他高新技術(shù)有機結(jié)合被發(fā)展應用于抗生素殘留檢測領域中，Ahmad S E等[20]首次設計了基于金納米顆粒和雙鏈DNA的熒光猝滅適配體傳感器來檢測牛奶中鏈霉素的殘留，當有鏈霉素存在時，適配體與靶標結(jié)合，致使金納米顆粒表面吸附FAM標記的互補鏈而保持良好的穩(wěn)定性，不發(fā)生聚集，并有效猝滅互補鏈的熒光，該方法具有優(yōu)異的選擇性，檢測限為34.7 μg/kg，遠低于規(guī)定的最高殘留限量200 μg/kg。Wei Sheng等[21]建立了具有雙重檢測模式的熒光免疫色譜法，以金納米顆粒為猝滅劑，實現(xiàn)快速半定量檢測牛奶中四環(huán)素類抗生素的殘留，包括四環(huán)素、土霉素、金霉素和強力霉素，檢出限為20 μg/kg，且不受其他獸藥的干擾。

熒光猝滅免疫分析法在一定程度上能有效消除背景熒光的干擾，從而提高方法的靈敏度與穩(wěn)定性，但在檢測過程中，可能由于其他因素導致熒光猝滅現(xiàn)象發(fā)生，因此其特異性還有待進一步加強。

5.2 熒光增強免疫分析(Fluorescence enhanced immunoassay，F(xiàn)EIA) 熒光增強免疫分析(FEIA)的原理與FQIA相似，是根據(jù)熒光信號強度增強的程度而實現(xiàn)檢測目的，該法同樣能消除背景熒光的干擾，因此具有較高靈敏度和穩(wěn)定性。Hongliang Tan等[22]在銀納米粒子(AgNPs)表面修飾Eu3+(鈾)，進行牛奶中四環(huán)素殘留的檢測，四環(huán)素與Eu3+形成的復合物在銀納米粒子的熒光增強效應作用下，發(fā)出的強熒光比普通情況下高4倍，與其他熒光檢測方法相比，不需要另外加熒光增強劑，簡化了操作步驟，且具有較高選擇性與靈敏度。 Saba Ershadi等[23]利用銀納米粒子對鋱的熒光增強效應建立了可定量檢測牛奶中恩諾沙星的分析方法，檢出限為21 μg/kg，定量限為69 μg/kg，方法靈敏度較高，且線性范圍良好。

此外，基于FEIA與FQIA的非標記免疫分析，由于省去了復雜的標記與修飾過程[24]，不僅降低了檢測成本，操作也更加簡單快捷，還能有效避免抗體標記過程中可能產(chǎn)生的影響，因此也開始引起國內(nèi)外科研人員的重視。

6 展望

雖然目前的熒光免疫分析方法相比傳統(tǒng)快速檢測技術(shù)在方法靈敏度、特異性等方面都有了較大改善與發(fā)展，但仍存在一些缺陷和不足，如量子點含有有毒重金屬離子而對生物體有一定危害性，熒光淬滅免疫分析方法易受基質(zhì)干擾，以及方法的準確度、精密度等參數(shù)波動大等。同時，由于實驗條件與實際生產(chǎn)條件存在差異，如牛奶基質(zhì)的干擾性較大，導致技術(shù)轉(zhuǎn)化難度大，產(chǎn)品穩(wěn)定性、保質(zhì)期與成本等問題一定程度上均阻礙了研究成果的商品化進程。而國家對抗生素殘留的限量要求也越來越嚴格，跟據(jù)農(nóng)業(yè)部第235號公告的規(guī)定[25]，大多數(shù)藥物是泌乳期禁用的，部分規(guī)定的抗生素殘留限量也較低，如芐星青霉素在牛奶中的最高殘留限量僅4 μg/kg。

為解決以上問題，研究者仍需努力研發(fā)應用具有更高靈敏度、更低檢測限的新型熒光免疫分析技術(shù)與標記物，也可將各方法有機結(jié)合，優(yōu)勢互補，創(chuàng)新現(xiàn)有檢測模式，在提高檢測效率的同時，降低檢測方法帶來的不良影響與污染，為奶業(yè)綠色安全發(fā)展保駕護航，為食品安全監(jiān)控做出更多的奉獻。同時，為滿足迅猛發(fā)展中的奶業(yè)市場需求，高通量檢測、自動化與智能化檢測等提高檢測效率的方法是未來熒光免疫快速檢測技術(shù)的必然發(fā)展趨勢，還可研發(fā)配套儀器實現(xiàn)定量檢測，結(jié)合二維碼或條形碼識別功能，連接網(wǎng)絡，實現(xiàn)數(shù)據(jù)上傳與共享、GPS實時定位等功能，有利于企業(yè)實時監(jiān)控鮮奶品質(zhì)，并在發(fā)現(xiàn)異常情況時能及時采取有效應對措施。